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以中藥為原料，在中醫(yī)藥理論指導下，根據處方將其制成適宜的中藥制劑，為保證中藥質量而對制劑各種檢查項目、指標、限度、范圍等所做的規(guī)定，形成了中藥制劑質量標準。但是，研發(fā)藥物過程中常常面臨變更后的產品是否與變更前產品具有相同療效和安全性這樣的問題，為此必須采用相關方法進行質量評估，即進行生物等效性研究。所謂生物等效性（bioequivalence，BE）是指同一種藥物的不同制劑在相同的實驗條件下，給予相同的劑量，反映其吸收速度和程度的主要動力學參數，沒有明顯的統(tǒng)計學差異[1]。 對于化學藥物制劑來說，藥物有效成分基本為單體，制備工藝過程嚴格按照《中國藥典》規(guī)定進行，質量較易控制，生物等效性研究體系也較為完善和成熟。然而隨著中藥新劑型的不斷發(fā)展及中藥現代化的進程，如何對中藥制劑產品進行生物等效性研究是中藥制劑質量控制的重點。同種中藥制劑，由不同生產廠家生產，所選原材料來自不同的產地，生產工藝也不盡相同，導致生產出的中藥制劑質量存在差異，因此為了確保中藥制劑產品療效和安全性，需對不同廠家生產的同種制劑產品進行生物等效性研究。同一中藥復方的不同制劑只有生物等效，它們在臨床上才具有相同療效和安全性，才可以相互替代使用，因此生物等效性研究在藥品研發(fā)與評價過程中發(fā)揮著至關重要的作用，是判斷所研發(fā)產品是否可替代已上市藥品的依據。 1 藥物生物等效性研究 通常意義的生物等效性研究普遍采用生物利用度方法，其研究反映了藥物制劑的生物學標準，能夠為臨床療效提供直接證明。目前實際要求進行生物等效性研究的藥物主要有2種：①改變劑型的產品；②改變處方與工藝的產品。例如，新藥開發(fā)過程中，擬上市藥品在劑型和生產工藝上，都有可能與臨床試驗用藥有所差異，這種差異可能源于生產廠家在大批量生產的過程中，相應地修改了藥物劑型和生產工藝；或是新藥產品被批準上市后，生產廠家對其生產設備、生產工藝、藥物劑型、原料藥質量標準、原料藥來源、原料藥的生產方法等進行相應地改進，無論哪種修改，變更前產品必須與變更后產品生物等效，從而確保變更后產品臨床上具有一定的安全性和有效性[2]。生物等效性研究思路見圖 1。 圖 1 生物等效性研究思路 Fig.1 Research ideas of bioequivalence 1.1 生物等效性的分類 從等效性的程度來看，生物等效性可分為平均生物等效性（average bioequivalence，ABE）、群體生物等效性（population bioequivalence，PBE）和個體生物等效性（individual bioequivalence，IBE）。 目前研究最多的是ABE，即人群使用T藥物與使用R藥物所得效應平均值相同。ABE研究較多采用雙順序雙周期交叉試驗，其缺點是只考慮了樣本平均參數，忽略了樣本個體間變異情況以及個體與藥物之間可能存在的相互作用，雖然保證平均效應相同，但不一定保證效應的變異度相同，即兩總體的均值相同，方差不一定相同。因此，PBE和IBE研究成為必要，研究前景廣闊。 PBE是指人群使用T藥物與使用R藥物所得效應不僅平均值相同，而且方差相同，即兩總體的邊緣分布相同。IBE是指對每個個體而言，使用T藥物與使用R藥物所得效應值接近，即總體平均值和個體內方差相同。從應用的角度來講，具有PBE的藥物具有處方可選擇性，而2個具有IBE的藥物具有用藥可交替性。顯然，如果個體等效，則群體等效；如果群體等效，則平均等效[3]，反之不然，從等效的程度來講，IBE＞PBE＞ABE。研究IBE和PBE必須采用重復交叉試驗設計，對于樣本容量的確定以及使用何種方法進行評價是目前研究的熱點，也是必須要突破和完善的。 1.2 試驗設計方法 1.2.1 平行設計 在平行設計中，無需交叉給藥，個體間差異對試驗影響較大，受試對象數至少是交叉設計的2倍，這無疑就增加了試驗量。所以只要操作可行，建議盡量采用交叉設計進行生物等效性研究。但是以下情況最好使用平行設計，如藥物的消除半衰期較長，因為交叉設計中需要足夠長的清洗期，這樣研究時間就會拖長，增加了試驗質量控制的難度和個體失訪的機會，因而難以實施交叉設計方法；高變異度的藥物，個體內的變異比個體間的變異大；增加受試者數量的費用比增加另一個給藥階段要小，且更容易實行；不能頻繁地對受試對象進行血液采樣等[4]。 1.2.2 交叉設計 交叉設計一般采用的都是2（順序）×2（時期）交叉試驗設計。由于多數藥物在不同個體間的清除率不同，個體間的變異系數遠遠大于個體內變異系數，所以通常采用2×2單劑量交叉試驗設計，這樣可以減弱試驗周期對試驗結果的影響，從而確保試驗的準確性。在該設計中，受試對象被隨機分為2組：第1組在第1時期接受A處理，第2時期接受B處理；第2組相反，即第1時期接受B處理，第2時期接受A處理。2種處理之間的清洗期要足夠長，根據試驗經驗總結，時間以藥物活性成分的5個以上的消除半衰期長度較為適宜。 2×2單劑量交叉試驗設計有很多優(yōu)點，首先是樣本容量少，效率高，有較高的精密度；其次可以減少個體差異造成的影響及次序的影響，將處理間的差異從試驗中分離出來。 1.2.3 重復試驗設計 重復試驗設計又稱為多交叉試驗設計，包括3時期的重復交叉設計和4時期的重復交叉設計，該設計同時適用于ABE、PBE和IBE的研究，優(yōu)點是處理順序較多，一次性可以研究多種藥物的生物等效性。但是實驗數據因要多組間比較，處理過程比較繁瑣，劉玉秀等[5]介紹了一種適合于多交叉設計的可信區(qū)間方法；Knorr等[6]采用開放、隨機的單劑量3周期交叉試驗設計，研究孟魯司特口服顆粒制劑和咀嚼片劑在健康人體空腹狀態(tài)時的生物等效性，通過比較藥動學參數，證明二者具有生物等效性，且耐受性良好。 2 中藥制劑的等效性研究 以化學成分的量為指標的藥學等效性、以藥理效應為指標的藥效學等效性及以生物利用度相關參數為指標的生物等效性研究共同組成了藥物的等效性研究，因而要從不同角度來考察受試制劑與參比制劑之間的可替代性[7]。 2.1 藥學等效性研究 束云[8]比較了復方丹參片和復方丹參滴丸中丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1這8種有效成分的量，差異較大，病患每次服藥量中有效成分攝入量也不同，因而2種制劑在臨床藥物治療效果也存在差異，不存在藥學等效性。為了更加深入地比較二者療效，還需進行藥動學研究及臨床療效研究。 2.2 藥理藥效學等效性研究 束云[8]又對復方丹參片和復方丹參滴丸進行了動物實驗研究，二者均有抗FeCl3引起的血管內皮損傷、減輕繼發(fā)的血小板活化和凝血系統(tǒng)激活、促進機體溶栓等作用，從而提高機體抗FeCl3致動脈血栓的能力，在同等生藥劑量方面，二者藥物作用無明顯差異，存在藥效學等效。但是，若按臨床用量的同等倍數劑量進行比較，復方丹參片在部分指標上優(yōu)于復方丹參滴九，因此還需進行更多臨床研究來確切評價二者療效。 孫蘭等[9]用NIH小鼠對以中藥配方顆粒和中藥飲片制備的小柴胡湯進行動物藥效對比實驗，表明二者均對小鼠硫代乙酰胺性肝損傷有保護作用；對化學法所致小鼠的扭體反應有抑制作用；對醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性增加有一定的抑制作用，但是中藥配方顆粒對肝損傷的保護作用似優(yōu)于中藥飲片，二者不等效；對鎮(zhèn)痛作用和對小鼠腹腔毛細血管通透性的抑制作用差異不顯著，二者具有等效性。該實驗結果為小柴胡湯中藥配方顆粒的臨床應用提供了動物實驗參考。 2.3 臨床藥效學等效性研究 霍巨等[10]采用隨機平行對照方法比較龍珠軟膏神闕貼敷與肛門納入這2種不同給藥方式治療Ⅱ度內痔的等效性，通過觀察臨床癥狀、痔核和不良反應，連續(xù)治療1個療程，結果發(fā)現這2種給藥方式的總有效率和痊愈率無明顯差異，二者均能達到有效治療效果，具有臨床等效性，肛門納入直腸給藥效果更迅速，而神闕貼敷經臍治療簡單方便。魏蘭福等[11]采用多中心、隨機、雙盲、平行對照的方法，分別予以良附丸中藥配方顆粒、良附丸飲片湯劑、安慰劑治療7 d，觀察病人治療前后臨床癥狀、生命體征及三大常規(guī)、肝腎功能，結果表明良附丸免煎配方顆粒對胃脘痛具有療效，與傳統(tǒng)中藥飲片湯劑療效相當，二者存在臨床等效性，并且安全無不良反應。 通過一系列臨床治療指標對2種制劑進行臨床藥效比較來證明二者是否存在臨床等效性，提示二者是否可以替代，有利于中藥更多新型制劑的開發(fā)研究，但是目前看來，一般臨床研究樣本容量較小，不具備嚴格的統(tǒng)計學意義，應進行更多相關臨床研究，樣品容量大小的估算也要參考各種因素。 3 中藥制劑的生物等效性研究現狀 中藥制劑的生物等效性研究是指在中醫(yī)藥理論的指導下，通過多角度、多層次、多途徑和多指標的考察，整體和綜合評價中藥的等量性和等效性的研究，指導臨床安全、有效、合理地應用中藥。中藥制劑生物等效性研究中的體內過程研究難度較大，目前方法主要有2類[12]：化學測定法和生物測定法，前者包括血藥、尿藥測定，用于活性成分明確且可用定量分析方法測定其體液藥物濃度的制劑；后者包括藥物累積法、藥理（毒理）效應法，用于活性成分明確但缺乏靈敏的體液藥物濃度測定方法或活性成分不明確的制劑。李學林等[13]提出廣義的中藥制劑等效性研究至少應該包括4個層次的研究：化學等量性研究、生物等效性研究、藥理等效性研究、臨床等效性研究，須采用多層次多指標相結合的方式，互為補充，綜合評價。目前已進行生物等效性研究的中藥制劑見表 1。 表 1 現有中藥制劑的生物等效性研究 Table 1 Bioequivalence studies of existing CMM preparation
過去幾十年里，借鑒化學藥的生物等效性研究方法是最原始的中藥制劑生物等效性研究方法之一。陳麗等[28]選取蘆丁為單一指標成分，以柿葉黃酮普通片為參比制劑，通過HPLC法測定兔血漿中蘆丁的濃度來進行柿葉黃酮緩釋片兔體內藥動學及其生物等效性研究，結果表明緩釋片與普通片生物不等效，前者在兔體內表現出較好的緩釋特性，生物利用度明顯高于普通片；張軍等[29]選取消糖靈分散片中格列本脲為指標成分，建立人血漿中格列本脲的LC-MS-MS聯用測定法，以市售格列本脲片為標準參比制劑進行消糖靈分散片生物等效性研究，結果表明實驗制劑與參比制劑的Cmax、AUC0～36等效。因此可以看出，采用生物利用度方法研究單體成分藥動學參數這一思路在中藥現代化的發(fā)展進程中起了不可替代的重要作用，很大程度上推動中藥在各方面的發(fā)展。但是，中藥始終與化學藥有較大差異，中藥成分復雜，單一成分的等效性研究并不能代表中藥本身，不能體現中藥整體性發(fā)揮療效的特點。 3.2 生物等效性研究代表性有效成分選取 選取復方中發(fā)揮治療效果的幾種有效成分，同時通過測定其在體液（一般是血漿）中的濃度來計算藥動學參數，從而來反映2種制劑是否生物等效。王長虹等[27]選取銀杏內酯A（GA）、銀杏內酯B（GB）、銀杏內酯C（GC）及白果內酯（BB）4種有效成分為考察指標，建立了測定血漿中GA、GB、GC及BB濃度的HPLC-MS方法，比較銀杏葉滴丸劑與片劑的藥動學參數，進行生物等效性評價。這種研究方法在原有選取單一成分的基礎上擴大了檢測指標范圍，為中藥制劑生物等效性研究提供了一種很好的思路，但是檢測的僅是各個單體成分的藥動學參數，各個單體成分之間并沒有體現中藥組分與組分之間以及中藥復方單味藥與單味藥之間的配伍關系，不能全面準確地評價中藥制劑產品生物等效性，因此該種方法有待進一步加強研究。 3.3 采用多角度相結合的方法進行生物等效性研究 近年來中藥指紋圖譜技術的逐漸成熟以及HPLC、GC、色譜-質譜聯用法（LC-MS、GC-MS、LC-MS-MS、GC-MS-MS）等色譜方法的迅速發(fā)展，及免疫法和微生物學方法的應用，都在一定程度上為中藥制劑等效性研究提供了極大的方便。張麗杰等[30]提出將中藥譜效關系研究定為繼中藥指紋圖譜之后更深入一層的科學研究方向，將中藥指紋圖譜中的化學成分與藥效結合起來，制定反映產品內在質量的控制標準而進行的研究，即中藥譜效學，這對確立中藥藥效物質基礎具有重要意義，也提示可將化學成分結合藥效應用于中藥制劑生物等效性研究中。 3.3.1 化學成分與藥效相結合 史萬忠等[31]通過比較指標成分及主要藥效的方法，研究了養(yǎng)血軟堅方不同提取方法的優(yōu)劣，通過測定和比較化學指標成分量，確定最佳提取工藝來確保該中藥復方發(fā)揮最大藥效是很必要的，因此與藥效相關的化學成分是值得繼續(xù)研究的。孟憲生[32]對復方葛根芩連湯不同提取方法進行生物等效性比較，研究3種提取方法對葛根芩連湯藥效的影響，該實驗將君藥葛根中反映藥效的葛根素這一化學指標成分與藥效相結合進行生物等效性研究，以AUC、Cmax、tmax為指標進行分析比較，無論哪種均不完全等效，綜合之后選擇復方仿生法作為提取方法。 3.3.2 化學成分、藥理作用與臨床療效相結合 許家騮等[21]通過多項藥理學指標的考察，研究補中益氣精制顆粒與同劑量的湯劑、丸劑的生物等效性，發(fā)現無明顯差異，并進行了三者的臨床觀察[33]，結果顯示顆粒劑和湯劑療效較佳，丸劑較差；測定3種劑型中黃芪甲苷的量，結果顯示顆粒劑中量最高，湯劑次之，丸劑最低，臨床療效恰好與此相對應。該實驗從藥理作用、臨床療效和化學成分組成3個角度進行研究，以多角度相結合的思路進行中藥制劑生物等效性研究是值得借鑒的。 4 通過生物評價實現中藥制劑生物等效性研究 美國食品與藥品管理局（FDA）早已認識到了植物藥的特殊性。由于植物藥的藥效成分不清晰，現有的分析檢測技術達不到其藥動學（包括生物利用度）研究要求，可通過生物效價檢測方法進行藥動學研究[34]，從而實現藥效穩(wěn)定一致。所謂生物效價檢測，就是以藥理為基礎，生物統(tǒng)計為工具，運用特定的試驗設計，利用生物體在一定條件下所產生的特定反應（可測定、量化生理指標或生物學特性的變化），來測定藥物生物活性（藥效、活力或毒力）的一種定量的方法，主要提供了與臨床療效一致的藥品生物活性信息[35]。 4.1 生物效價檢測在中藥中的應用 中藥是一個復雜的生物體系，中藥的質量控制和評價一直以來都是中藥新藥研發(fā)的難點。生物效價分析方法為中藥質量控制提供了一種新的研究思路，在一定程度上吻合中藥多成分、多靶點、多途徑的作用特點。目前建立中藥生物效價評價方法已有較多報道[36]，宋雨澤等[37]建立以拮抗纖維蛋白原作為生物效價的評價方法，得出熟大黃（酒蒸）的活血化瘀功效高于生大黃和大黃炭；陳廣云等[38]建立三棱抗凝效價的檢測方法，對不同產地藥材的活血化瘀效應進行評價，并通過三棱抗凝效價與阿魏酸、總黃酮量之間的相關性分析，探究其藥效物質基礎，得到三棱抗凝效價與上述二者的量無顯著性相關，需尋求相關性更高的活性成分來建立更加完備的三棱品質評價體系。 4.2 基于生物熱活力表達的生物效價檢測 肖小河等[39]從物質內涵、生產工藝對物質內涵的影響效應、內在質量控制模式和方法及原料、半成品和成品生產質量的關聯管理4個方面進行分析，將生物熱動力學方法作為一種有用的生物效價檢測手段應用于中藥藥效、品質等評價[40]。趙艷玲等[41]發(fā)現板藍根中有機酸、多糖的量與品質有一定的相關性，采用基于生物熱活性表達建立的板藍根品質評價模型提示板藍根的品質優(yōu)劣是抗菌、抗病毒和免疫促進3方面的生物活性的綜合表現。 4.3 生物效價檢測促進中藥制劑等效性研究 中藥成分復雜，很難找到具有代表性的有效組分作為指標成分，張海珠等[42]在生物效價的基礎上提出以“效應當量”來評控中藥質量，只有保證了“效應當量一致性”，即有效物質發(fā)揮生物效應總量的等效性，才能最大限度地保證中藥質量，指導臨床用藥。同樣，對于中藥制劑來說，個別成分的等效性研究不能體現其整體作用；另外，藥物在體內吸收代謝過程復雜，使“組合成分”研究也會有困難，因此通過多組分結構的研究來控制中藥質量會有很大的挑戰(zhàn)。而生物評價的本質核心就是能夠針對中藥多成分、多靶點、多途徑的特點，所以可以通過藥效等同、關聯功效的生物評價方法來實現中藥生物等效性研究。 5 基于“組分結構”理論的中藥制劑生物等效性研究思路 近年來，國際市場對中藥給予越來越濃厚的興趣，但市場上中藥制劑的質量良莠不齊，同種制劑療效差異也很大。中藥的一大特色是多組分，大多數單一組分又多含有多個成分，復雜性和整體性是研究中藥復方的兩大難點。筆者課題組提出“組分結構理論”[43]，認為中藥物質基礎是多成分構成的，而且多種成分并不是簡單的堆積，而是一個有序的整體，單體成分是其最基本的單位，相似的單體成分按照一定的比例構成組分，不同的組分又按照一定的比例構成中藥的整體，即“三個層次多維結構”。中藥制劑發(fā)揮療效強調的是其整體的協同作用，其中既包括有效組分，也包括功能組分（功能組分是對有效組分具有增溶或/和促進吸收等輔助功能的成分/組分）。當前中藥制劑的生物等效性研究較為模糊，筆者認為，僅用指標性成分考察中藥制劑的療效是不合理的，中藥制劑的生物等效性研究必須是宏觀到微觀整體系統(tǒng)的研究，從組分層面到“組分構成”層面，結合量與療效關系的考察及“組分構成”合理配比的微觀概念，深入控制中藥制劑的質量。 本課題組以丹參滴注液為例，說明如何構建基于“組分結構”理論的中藥制劑生物等效性研究。丹參滴注液是臨床常用的一種以丹參提取物為原料的藥物，臨床常用于冠心病胸悶、心絞痛等，其發(fā)揮功效的物質基礎由酚酸組分和多糖組分共同構成，協同發(fā)揮整體性防病治病作用。本課題組基于組分結構理論，基本清晰闡明了酚酸組分內10個成分的組成結構及多糖組分9個糖類化合物組成，這些成分所占的量比例穩(wěn)定，存在一定組成結構特征，組分內成分之間也存在一定的組成結構比。其次對丹參滴注液的劑型特征進行控制，如pH要求、滲透壓、劑型輔料本身及輔料引入的雜質等。本課題組采取pH穩(wěn)定技術，有效降低了澄明度不合格率，保證了產品質量的穩(wěn)定性，然后對制劑過程進行動態(tài)質量控制。本課題組對丹參藥材、精制液、成品以多個指標進行了定量測定，跟蹤監(jiān)測了主要指標性成分的量變化，采取可行措施，保證了最終產品質量的一致性。該理論有利于中藥制劑產品安全性和有效性物質基礎的質量控制，胡紹英等[44]指出不同廠家生產出的丹參注射液質量存在顯著差異，因此為了控制丹參注射液的質量和療效，結合“組分結構”理論，從原藥材、制劑工藝過程、輔料等方面對丹參注射液進行全過程、動態(tài)的質量控制，提出丹參注射液多維結構全過程動態(tài)質量控制技術體系，從而得到質量穩(wěn)定、安全的產品。 本課題組提出將結合“組分結構”理論研究中藥制劑的生物等效性，首先要對中藥制劑的質量進行控制，采用多層次、多途徑、多維結構相結合，基于組分結構-藥理-藥效研究模型，優(yōu)化組分間及組分內的最佳配比結構，結合藥效，構成“質-效”的空間層次效應，多角度、多方面地對中藥制劑的質量進行分析、整理和控制，在此基礎上進行生物等效性研究，當然，找出一條適合中藥的生物等效性研究模式還需更加深入思考和努力。 6 結語 由于中藥本身的特殊性，很難找到具有代表性的有效組分作為指標成分，如何建立更為合適的中藥制劑生物等效性研究體系一直是中藥科研人員研究的難點?；谥兴幾饔玫亩喑煞?、多靶點、多途徑的“組分結構理論”是從宏觀到微觀整體把握中藥組分，中藥制劑是中藥現代化的主要形式，是今后中藥研究的重點，而中藥制劑生物等效性研究體系的發(fā)展對于中藥制劑新劑型的發(fā)現與創(chuàng)新必不可少，因此加強中藥制劑生物等效性研究迫在眉睫，還需眾多中藥人的不懈努力。 參考文獻（略） 此文摘自：張多多, 韓秀娟, 侯雪峰, 汪剛, 顧俊菲, 宋捷, 封亮, 賈曉斌 . 生物等效性研究方法及其在中藥制劑產品中的應用[J]. 中草藥, 2016, 47(20): 3712-3719 |
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