酵母雙雜交的目的是檢測(cè)兩種蛋白的是否有相互作用。
基本原理
酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song等首先在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立 i 。典型的真核生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子， 如GAL4、GCN4、等都含有二個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域: DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activating domain)。前者可識(shí)別DNA上的特異序列， 并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游， 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用， 啟動(dòng)它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。二個(gè)結(jié)構(gòu)域不但可在其連接區(qū)適當(dāng)部位打開(kāi)， 仍具有各自的功能。而且不同兩結(jié)構(gòu)域可重建發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過(guò)激活報(bào)道基因的表達(dá)探測(cè)蛋白－蛋白的相互作用。主要有二類(lèi)載體: a 含DNA -binding domain的載體; b 含DNA-activating domain的載體。上述二類(lèi)載體在構(gòu)建融合基因時(shí)， 測(cè)試蛋白基因與結(jié)構(gòu)域基因必須在閱讀框內(nèi)融合。融合基因在報(bào)告株中表達(dá)， 其表達(dá)產(chǎn)物只有定位于核內(nèi)才能驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。
酵母雙雜交系統(tǒng)的建立與發(fā)展是基于對(duì)真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控起始過(guò)程的認(rèn)識(shí)。真核生物中存在一種上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)，其作用是和激活蛋白結(jié)合并大大增加啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄速度，從而在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)靶基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄起始需要反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。很多真核生物的位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)錄激活因子是組件式的，通常具有兩個(gè)可分割開(kāi)的結(jié)構(gòu)域，即DNA特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain, BD)與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcriptional activation domain, AD)。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域即使分開(kāi)時(shí)仍各具功能，互不影響。但一個(gè)完整的某個(gè)特定基因的轉(zhuǎn)錄激活因子必須同時(shí)含有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，否則無(wú)法完成激活功能。只有將這兩部分通過(guò)適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上接近才能恢復(fù)其激活轉(zhuǎn)錄的能力。不同來(lái)源的ＢＤ與ＡＤ結(jié)合后則特異地激活ＢＤ結(jié)合基因的表達(dá)?；谶@一特性，F(xiàn)ields等設(shè)計(jì)了一個(gè)檢測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng)。選擇的轉(zhuǎn)錄激活因子是酵母細(xì)胞中的GAL4蛋白。分離GAL4蛋白N端的1-147個(gè)氨基酸（BD）和C端的768-881個(gè)氨基酸（AD），分別構(gòu)建重組質(zhì)粒。如果在BD上接上一個(gè)蛋白X，在A(yíng)D上接一個(gè)蛋白Y，再將這二個(gè)質(zhì)粒共同導(dǎo)入酵母菌中，若X，Y蛋白在酵母內(nèi)發(fā)生交互作用，則相當(dāng)于將GAL4的BD和AD又連在一起，即可以轉(zhuǎn)錄激活下游報(bào)告基因的表達(dá)，通過(guò)測(cè)定報(bào)告基因的產(chǎn)物及活性來(lái)檢測(cè)這種交互作用的發(fā)生。理論上，任何能在酵母中表達(dá)的基因均可作為報(bào)告基因，較為常用的是LacZ，和一些營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記，這種報(bào)告基因只允許陽(yáng)性克隆生長(zhǎng)，最常用的是HIS3和LEU2。近來(lái)為了更靈敏、特異地篩選陽(yáng)性克隆,常同時(shí)使用兩種或兩種以上的報(bào)告基因(如ADE2和URA3)，一則它可以允許用比單純顏色篩選更大的菌落密度鋪板，從而獲得較豐富的表達(dá)產(chǎn)物，二則雙重篩選相互驗(yàn)證，可以排除一些假陽(yáng)性結(jié)果；三則轉(zhuǎn)化體制造了大量的融合蛋白以保證基因產(chǎn)物滿(mǎn)足生長(zhǎng)需要，結(jié)果LacZ轉(zhuǎn)錄提高，從而β-半乳糖苷酶的活性亦增強(qiáng)。
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