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在分子機(jī)制的研究中，蛋白和蛋白之間的互作研究可以說(shuō)是非常經(jīng)典了，因?yàn)樵谑畮啄昵埃蠹覍?duì)非編碼RNA的研究還沒(méi)有現(xiàn)在這么熱，因?yàn)檠芯康姆肿邮堑鞍?，找的靶分子也是蛋白，研究的文章發(fā)在JBC雜志上的也非常多。 小張有時(shí)在想，JBC作為老牌名刊，盡管雜志不能只看影響因子，不過(guò)近幾年影響因子怎么一直在降呢？都快跌破4分了。當(dāng)然，JBC不是今天的主題，我們主要說(shuō)蛋白和蛋白作用。研究蛋白作用的方法有很多，今天我們介紹三個(gè)：酵母雙雜交，CoIP和GST-pulldown。 酵母雙雜交(Yeast Two-Hybrid System,Y2H) 酵母雙雜交技術(shù)是驗(yàn)證蛋白間相互作用的經(jīng)典方法之一。原理是在真核細(xì)胞調(diào)控轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合域BD與轉(zhuǎn)錄激活域AD在分離的時(shí)候不具有轉(zhuǎn)錄激活功能，而當(dāng)兩者結(jié)合在一起才具有完整的轉(zhuǎn)錄激活因子的功能。因此，我們將所要研究的目的基因（蛋白A和蛋白B）分別裝載到這兩個(gè)質(zhì)粒載體中，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域序列則分別與基因的ORF進(jìn)行融合。當(dāng)轉(zhuǎn)入相應(yīng)酵母菌株后，若在酵母內(nèi)表達(dá)的不同蛋白發(fā)生互作，則將使GAL4-BD和GAL4-AD相互靠近結(jié)合，再進(jìn)一步與上游激活序列結(jié)合，激活相應(yīng)報(bào)告基因的表達(dá)。 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP） 免疫共沉淀是另一種研究蛋白相互作用的經(jīng)典方法。原理是如果蛋白A與蛋白B（直接或間接）結(jié)合，那么當(dāng)我們用抗體去結(jié)合蛋白A的時(shí)候，蛋白B也能被拉下來(lái)；當(dāng)然，反之亦然。因此，首先提取蛋白，然后在提取的蛋白中加入蛋白X的抗體，孵育后再加入Protein A或G(于Agarose 或magnetic beads等介質(zhì)上)，然后變性、聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)過(guò)Western Blot檢測(cè)蛋白B，當(dāng)然，也可以直接將沉淀下來(lái)的蛋白通過(guò)質(zhì)譜分析其它蛋白。 GST-pulldown GST pulldown 是另一項(xiàng)驗(yàn)證蛋白相互作用的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，其基本原理是將靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶）融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹(shù)脂上,作為與目的蛋白親和的支撐物,充當(dāng)一種“誘餌蛋白”,目的蛋白溶液過(guò)柱,可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白),洗脫結(jié)合物后通過(guò)WB或者質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。 以上三種方法是研究蛋白互做最常用的三種方法，一般Y2H常用來(lái)篩選，Co-IP和GST pulldown用來(lái)驗(yàn)證。研究不僅在整體蛋白層面，還包括蛋白的結(jié)構(gòu)域?qū)用妫珿ST pulldown是用來(lái)驗(yàn)證蛋白A與B的直接結(jié)合的，而Y2H和Co-IP結(jié)果則還有間接作用以及非特異性作用。 最后附上五篇使用以上三種方法研究蛋白質(zhì)互作，發(fā)表在JBC雜志上的經(jīng)典文章：
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