江麗娜¹  趙瑞利¹  雷連成¹  王教玉²  韓文瑜¹

1.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院      2.吉林省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站

在治療高等動(dòng)物發(fā)生的各種細(xì)菌性、病毒性疾病及其它病害中，由于大量使用抗生素，某些病原體對(duì)藥物產(chǎn)生了耐藥性，因而無法有效地控制疾病的發(fā)生。而篩選新的抗生素也極為困難，特別是人類真菌病害在當(dāng)前仍是一個(gè)難以解決的問題?？咕牡陌l(fā)現(xiàn)，尤其是抗菌肽對(duì)耐藥致病菌有良好的殺滅作用無疑為治療這幾類病害提供了新的途徑?？咕幕钚詮?qiáng)、功能廣泛，在應(yīng)用研究中有重要價(jià)值，這個(gè)新領(lǐng)域引起了越來越多的研究者的關(guān)注?？咕暮铣傻乃俣确浅？?，與以恒定速度合成的肽鍵相比，抗菌肽的產(chǎn)生比IgM快100多倍，因此稱抗菌肽是機(jī)體理想的第一道防線。到目前為止，多個(gè)魚類抗菌肽基因不僅被分離下來，在活體內(nèi)還對(duì)其進(jìn)行了表達(dá)。

一、魚類抗菌肽的生化特點(diǎn)和組成

魚類抗菌肽是一類小分子蛋白質(zhì)，其組成和結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，分子量大小和氨基酸組成各不相同，但是他們根據(jù)一定的特點(diǎn)，例如含有較多的半胱氨酸，形成較保守的α-螺旋結(jié)構(gòu)；含有較多的陽離子氨基酸例如精氨酸或賴氨酸而使分子帶正電。根據(jù)其生化和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可將它們分為幾種類型：

第一類，富含某種氨基酸的線性抗菌肽。此種類型的抗菌肽由于富含一些堿性氨基酸而帶正電荷，在與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用時(shí)可以折疊成有利于穿膜的疏水或雙親性α-螺旋結(jié)構(gòu)，能選擇地作用于細(xì)菌外層細(xì)胞膜的某些組分，如帶陰離子的磷脂，增大其滲透性而殺死或抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。這類分子還包括來源于虹鱒血清的salmocidin；八目鰻小腸的HFIAPs(hag fish intestinal antimicrobial peptides)；分離自泥鰍的misgurin；來源于雜交斑紋鱸魚皮膚、鰓和血液肥大細(xì)胞的piscidins以及分離自美洲擬鰈和豹鰨體表粘液的pleurocidins和pardaxins等，其中，由Brocal I，Falco A等人從刺泥鰈中的皮膚黏液中分離出一種25個(gè)氨基酸的線性抗菌肽Pleurocidin (Ple) ，具有與其他許多抗菌肽類似的兩親性α—螺旋結(jié)構(gòu)鱸魚的皮膚和腮可表達(dá)分泌moronecidin抗菌肽。鱸魚moronecidins前體肽有79個(gè)氨基酸殘基，由信號(hào)肽、成熟肽和C端pro片段3部分組成，氨基酸殘基數(shù)分別為22、22和35。經(jīng)圓二色譜分析其結(jié)構(gòu)呈α-螺旋。

第二類，含多個(gè)半胱氨酸分子內(nèi)形成環(huán)狀抗菌肽這類抗菌肽由于含多個(gè)半胱氨酸而形成多個(gè)二硫鍵從而使其二級(jí)結(jié)構(gòu)呈β折疊。這類分子包括來源于羅非魚的hepcidin和從克海七鰓鰻的皮膚上分離到富含半胱氨酸和精氨酸的多肽LCRP(lamprey corticostatin-related peptide)等，其中hepcidin基因，大概含有20～25個(gè)氨基酸殘基，內(nèi)部有八個(gè)高度保守的半胱氨酸，形成四個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，它有三個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子，其中有一個(gè)長(zhǎng)為273bp的ORF順序，編碼一個(gè)含有90多個(gè)氨基酸殘基的前多肽原，前多肽原包含三個(gè)區(qū)域，信號(hào)肽、成熟肽和由40個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的前hepcidin原，羅非魚hepcidins類型目前報(bào)道有3種，分別命名為TH1-5、TH2-2和TH2-3，前體肽分別有88、86和91個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量分別對(duì)應(yīng)為9.5、9.4和9.8 ku，三信號(hào)肽裂解位點(diǎn)分別位于第24～25、第22～23和第24～25密碼子上，在共同的保守區(qū)域，都含有8個(gè)半胱氨基酸，羅非魚中的TH2～3和日本鰈魚的JF2相似，TH2-2和日本的JFl相似，TH1-5和鯛的hepcidin類似，通過晶體結(jié)構(gòu)模型，表明，在半胱氨基酸部位都形成了二硫鍵，從斑馬魚分離的β-defensins有3種，分別命名為zfDB1、zfDB2和zfDB3。與哺乳動(dòng)物β-defensins相同，三者的成熟肽都有6個(gè)半胱氨酸，形成3個(gè)二硫鍵，并且形成的模式一致，即第l～5、第2～4和第3～6個(gè)半胱氨酸。結(jié)構(gòu)都呈β-折疊，但zfDB1的N端有一個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)。

第三類，組蛋白樣抗菌肽(histone-like proteins，HLPs)。這類肽在水生動(dòng)物中僅在魚類中有發(fā)現(xiàn)，其它如蝦類、貝類中尚未見報(bào)道。如從鯰、斑、斑紋鱸魚、銀大麻哈魚和鮭等的皮膚粘液、鰓、血液和肝臟組織中分離的parasin I、HLPs和SAM等，氨基酸序列和質(zhì)譜分析表明，它們與組蛋白H2A、H2B或Hl非常相似。從大西洋鮭皮膚黏液分離的SAMP H1(salmonantimicrobial peptide H1)含有30個(gè)氨基酸殘基，中間富含Pro，N端乙?；?，但對(duì)其抗菌活性沒有影響，理論相對(duì)分子質(zhì)量為2836u。經(jīng)圓二色譜分析，其活性形式比非活性形式在分子結(jié)構(gòu)上顯得更緊湊和更具剛性。從鮒魚紅細(xì)胞上分離得到的一種特異的組蛋白H1與SAMP H1的氨基酸順序有78％的同源性，有三個(gè)信號(hào)肽切割位點(diǎn)，是鮒魚紅細(xì)胞上一種新發(fā)現(xiàn)的抗菌肽。從鯰魚受傷皮膚黏液分離得到的parasin I是由H2A組蛋白經(jīng)酶cathepsin D在其N端Serl9-Arg20位置裂解作用后產(chǎn)生的一種抗菌肽。parasin I含有19個(gè)氨基酸殘基，具有廣譜抗菌活性。Jorge等從彩虹鮭魚的皮膚分泌物中分離提取到了一種新的抗菌肽OncorhyncinⅡ，指出這種抗菌肽的前17個(gè)氨基酸殘基與來自于彩虹鮭魚組蛋白Hl的138～154個(gè)殘基相同，并測(cè)得其分子量為719513Da。從而指出這OncorhyncinⅡ抗菌肽是組蛋白Hl的C末端69殘基的片段。從鱈魚(體表粘液中分離出來的幾種抗菌抗菌活性因子，通過弱陽離子的交換色譜法和反相色譜層析技術(shù)，分離出來了三種小肽，通過N-端和C-端氨基酸順序分析和質(zhì)譜分析，它們分別為核糖肽類L40(6397Da)、L36A(12340Da)、L35(14215Da)。

第四類，經(jīng)酰胺化、糖基化修飾的抗菌肽。這些肽由核糖體合成以后在高爾基體濃縮、加工時(shí)，在相關(guān)酶的作用下脫掉C-端一個(gè)或多個(gè)氨基酸，或再與一些糖基結(jié)合而變成有活性的成熟肽。這類肽在蝦類和一些海水魚類比較常見。如從健康的南美白對(duì)蝦的血細(xì)胞和血漿中分離了幾種抗菌活性因子，通過酶剪切、Edman降解、質(zhì)譜儀分析等方法以及從血細(xì)胞的cDNA庫(kù)中進(jìn)行cDNA克隆，測(cè)定序列，發(fā)現(xiàn)南美白對(duì)蝦抗菌肽penaeidins具有其中一種肽的N-端因形成焦谷氨酸而封閉；C-端由于谷氨酸在成熟肽中被去掉而酰胺化等等。但由于它們的N-端富含脯氨酸，而C-端含有由6個(gè)半胱氨酸組成的3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，使它們的結(jié)構(gòu)有別于其它類群的抗菌肽。還有從鯉體表粘液中分離的27KD疏水蛋白和從丁鯛和鰻鱺皮膚粘液中分離的分子量分別為65KD、49KD和45KD三種抗菌肽，也是經(jīng)糖基化修飾的多肽。Jorge等從彩虹鮭魚的皮膚中分離得到了一種新的具有抗菌功能的核糖肽類，測(cè)得其分子量大小為667616Da，并指出這種肽與40S的核糖體蛋白S30非常相似。Jorge等又從彩虹鮭魚的血細(xì)胞中分離得到具有抗菌特性的活性片段，研究得出這種活性片段對(duì)熱敏感且能被蛋白酶所消化，從而推斷這一活性片段為一種類似蛋白質(zhì)的具有抗菌性的天然成分。

二、魚類抗菌肽的基因結(jié)構(gòu)和功能

隨著研究的深入，一些重要的抗菌肽基因正陸續(xù)被克隆。2006年中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院的劉碧蓮等人根據(jù)GenBank中收錄的魚類抗菌肽hepcidin的cDNA序列設(shè)計(jì)特定的引物，用RT－PCR方法從從鱖魚肝臟中克隆到hepcidin的cDNA，并構(gòu)建Pmd18-Thepcidin載體進(jìn)行序列測(cè)定和分析，結(jié)果表明，該cDNA長(zhǎng)為38lbp，其中第20～277位該基因的開放閱讀框(ORF)，編碼86個(gè)氨基酸，形成由信號(hào)肽(24個(gè)殘基)、前肽(42個(gè)殘基)和成熟肽(20個(gè)殘基)3部分序列組成的前體肽，與已報(bào)道的其他鱸形目魚類hepcidin相比較，核苷酸序列的同源性為72.2％～92.0％，所推導(dǎo)的成熟肽與包括人類在內(nèi)的其他生物的hepcidin成熟肽的同源性在50％～86.4％，Park等經(jīng)質(zhì)譜和化學(xué)分析方法研究正式，8個(gè)保守的cys殘基間形成4個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵，分子呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)。4個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵可使β-折疊結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定。由Campagna S，Saint N等人2007年從條紋鱸魚的肥大細(xì)胞里分離出了Piscidin抗菌肽，他們通過采用脂分子雙層的結(jié)構(gòu)分析和電生理實(shí)驗(yàn)研究了這個(gè)包括22個(gè)氨基酸殘基的陽離子肽的抗菌機(jī)制，圓二色性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)piscidin在水中是無組織的但是卻有一個(gè)高度緊密的alpha-helix，8-17個(gè)氨基酸殘基在微胞的環(huán)境當(dāng)中具有alpha-helix，由于有界限清楚的疏水和親水的區(qū)域，這個(gè)分子有兩親性的特性。這種結(jié)構(gòu)和那些能使細(xì)菌細(xì)胞膜通透性增加的陽離子肽的結(jié)構(gòu)非常類似。Piscidin混合到偶氮植物凝血素二維的雙分子層多通道實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在不同的濃度下會(huì)出現(xiàn)一個(gè)I-V曲線而且非常明確的表明肽分子能使細(xì)菌細(xì)胞膜通透。這個(gè)孔形成的活力通過單通道實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了。離子通道的特性更加明確的表明了piscidin通過螺旋的孔道結(jié)構(gòu)更能使細(xì)菌透化而不是通過“桶-桶板(barrel-stave)模型”。A．Falco等從鮭科EST數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)取了紅鱒魚β-防御素類抗菌肽的順序稱為c．mykiss β-defensin-1(omBD-1)，signal P 3.0 program分析發(fā)現(xiàn)，在omBD-1的的19位后有一個(gè)假定的切割位點(diǎn)，切割位點(diǎn)后有一個(gè)含有41個(gè)氨基酸的前體肽和β-防御素共有的順序一樣，也有6個(gè)保守的保守的cys殘基，它和從其它魚類中分離得到的β-防御素類抗菌肽有85.7％的同源性，同人類有34.9％的同源性，omBD-1有一個(gè)+2價(jià)的陽離子，等電點(diǎn)為8，這有助于omBD-l與細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)合。

近年來的研究重點(diǎn)正在向建立水生動(dòng)物免疫特異性cDNA文庫(kù)和表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)方面轉(zhuǎn)移，這將有助于發(fā)現(xiàn)更多的抗菌肽基因。N a m等構(gòu)建了日本鰈類魚的cDNA和ESTs文庫(kù)，從中鑒定了許多免疫相關(guān)基因，如Mx蛋白基因、補(bǔ)體基因、干擾素調(diào)節(jié)基因等；從兩種白對(duì)蝦的ESTs庫(kù)中，發(fā)現(xiàn)了44個(gè)免疫功能相關(guān)基因，全部免疫ESTs中，屬于抗菌肽的ESTs數(shù)量占總量的60％以上。由此可見抗菌肽的種類數(shù)目非常龐大，在水生動(dòng)物中的分布也十分廣泛。

三、魚類抗菌肽的生物學(xué)活性與功能

魚類抗菌肽是魚體非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，當(dāng)魚體受到損傷或病原微生物侵襲時(shí)，能迅速產(chǎn)生抗菌肽以預(yù)防和殺傷病原微生物的入侵，其合成速度快，在體內(nèi)擴(kuò)散迅速、靈活的特點(diǎn)是其他大分子蛋白質(zhì)(如抗體等)和免疫細(xì)胞所不具備的。隨著經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的發(fā)展，細(xì)菌和病毒對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖的影響越來越嚴(yán)重，而且沒有一種有效的治療試劑來抑制魚體病原菌的感染，抗菌肽的鑒定和特點(diǎn)受到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重視。編碼Ple前肽原的基因組順序已經(jīng)從刺泥鰈中分離下來，在無病毒啟動(dòng)子的控制下成功克隆到了載體上，通過這種結(jié)構(gòu)，生物活性的Ple轉(zhuǎn)化到魚體細(xì)胞株上，并持續(xù)增長(zhǎng)了連續(xù)兩年多。而且，對(duì)于Ple處理加工，成熟，分泌(通過使用綠色熒光蛋白融合技術(shù))的研究，分泌的重組Ple抗菌肽具有很高的抗菌活性(在未經(jīng)過濃縮的細(xì)胞懸浮液中發(fā)現(xiàn))，在此之前，沒有別的重組Ple抗菌肽或魚體抗菌肽表達(dá)到這種程度。這樣一個(gè)重組Ple抗菌肽或其它相關(guān)抗菌肽的過度表達(dá)可能會(huì)提高發(fā)現(xiàn)新的抗菌藥物的機(jī)會(huì)。張寧應(yīng)用分子生物學(xué)手段和生物信息學(xué)手段，通過化學(xué)合成從海馬體內(nèi)得到了足量的抗菌肽HKPLP．HKPLP對(duì)l0種人和魚類致病菌或條件致病菌株的活性實(shí)驗(yàn)表明，HKPLP對(duì)大多數(shù)的Gram<+>菌和Gram<－>菌都敏感，其最小抑菌濃度(MIC)大多不超過16μg/ml，對(duì)白色念珠菌的MIC為32μg/ml，對(duì)銅綠假單胞菌、副溶血弧菌和鰻弧菌等三種魚類致病菌的作用較弱，盡管HKPLP對(duì)人紅細(xì)胞有一定的溶血活性，但在對(duì)大多數(shù)測(cè)試菌株有效的抑菌濃度下，溶血活性不超過20％。此外，還發(fā)現(xiàn)HKPLP對(duì)Hela、U25l和C6等幾種癌細(xì)胞有顯著的細(xì)胞毒作用，IC<50>為18～40μg/ml，而且該作用發(fā)生迅速，可能與海馬的抗腫瘤活性有關(guān)。

Pan CY，Chen JY等人從鱸魚鰓中分離得到的Epinecidin-1抗菌肽。鱸魚epinecidin-l的多克隆免疫組織化學(xué)分析表明這種抗菌肽和它的抗體局限分布于鰓和小腸內(nèi)。鱸魚的兩個(gè)合成肽g-ple 22-5l and g-ple 22-42對(duì)對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌(如B. subtilis；S．aureus和P．putida)和革蘭氏陰性細(xì)菌(如E. coli；S. typhimurum和serratia Sp)真菌(C. albicans;C. neoformans和S. cerevisiae)都表現(xiàn)了強(qiáng)烈的抗菌活性，除此之外，在鱸魚和羅非魚體內(nèi)注射弧菌屬vulnificus后抗菌肽通過處理能夠顯著增加魚的生存量，這些結(jié)果對(duì)于研制魚類病原菌感染的預(yù)防劑和治療劑提供了一定的依據(jù)特別是對(duì)魚類的細(xì)菌感染中的免疫缺陷起到了改善的作用。生長(zhǎng)于極地海洋環(huán)境的魚類其血清具有高水平的抗凍蛋白(AFP)或抗凍糖蛋白(AFGP)，能通過阻止冰晶的形成而降低結(jié)冰溫度，它成為第二個(gè)常用的外源基因，通過轉(zhuǎn)AFP基因以提高受體魚的抗凍能力在鰈形目中發(fā)現(xiàn)了分子量較大的抗菌肽，它們具有相似的結(jié)構(gòu)特征，均富含丙氨酸和α螺旋結(jié)構(gòu)，此分子的發(fā)現(xiàn)和對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能的深入研究將可促進(jìn)轉(zhuǎn)抗凍蛋白基因魚類的研制進(jìn)程。

四、抗菌肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用前景

隨著人口的增加和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迅猛發(fā)展，全球性的環(huán)境污染日益加重，水環(huán)境出現(xiàn)了有機(jī)物和無機(jī)物富營(yíng)養(yǎng)化、重金屬離子和某些難降解的農(nóng)藥、有害化學(xué)成分富集等現(xiàn)象。同時(shí)養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的排泄物和殘餌等超過了水環(huán)境的自凈能力，進(jìn)一步加劇了水環(huán)境的污染程度，因而使水產(chǎn)養(yǎng)殖品種頻頻發(fā)生各種細(xì)菌性和病毒性疾病。防治過程大量地使用抗生素或其它藥物，破壞了水環(huán)境的微生態(tài)平衡，某些病原體對(duì)藥物產(chǎn)生了耐藥性，因而無法有效地控制疾病的發(fā)生。由于缺乏有效的防治措施，嚴(yán)重地制約著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因此，加快對(duì)主要水產(chǎn)養(yǎng)殖品種免疫防御的基礎(chǔ)研究，調(diào)動(dòng)、開發(fā)其自身的防御潛力，是開展健康養(yǎng)殖、實(shí)現(xiàn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要戰(zhàn)略之一。水產(chǎn)動(dòng)物抗菌肽的研究加深了人們對(duì)低等脊椎動(dòng)物免疫防御機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為日益嚴(yán)重的魚類病害防治開辟了嶄新的途徑。同時(shí)隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，人們有可能通過轉(zhuǎn)抗菌肽基因獲得抗病新品種。有理由相信，隨著研究的不斷深入，水產(chǎn)動(dòng)物抗菌肽將對(duì)世界水產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展起到重要的作用。

五、展望

隨著人們對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物各種抗菌肽的分離、結(jié)構(gòu)和功能的研究，改造并合成既有穩(wěn)定高效抗菌活性又具特異抗菌譜且同時(shí)對(duì)宿主無害的抗菌肽基因，并通過基因工程進(jìn)行表達(dá)，實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)，是人們研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外養(yǎng)殖業(yè)和飼料加工發(fā)展很快，抗菌肽作為新型飼料添加劑具有極大的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。通過移植功能強(qiáng)大的抗菌肽基因獲得轉(zhuǎn)基因魚、蝦類抗病品種，通過提高其自身的免疫能力增強(qiáng)抗病力，應(yīng)是完全可行和有效的。

（信息來源：《中國(guó)水產(chǎn)》2008.5）