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本研究共納入 197 例患者，其中腫瘤病例 121 例，正常病例 76 例。評估和分析了四種生物標志物：FIT、KRAS 突變、m3 和甲基化，這是臨床 CRC 診斷中最受認可的標準。結(jié)果顯示，F(xiàn)IT 陽性患者 40 例，占 20.3%。FIT 的診斷性能為 0.59，早期 CRC（I 期，無顯著）患者為 0.579，晚期 CRC（II/III 期）患者為 0.621（?圖 2A-C?）。CRC 患者 KRAS 突變發(fā)生率也隨之檢測，陽性 63 例，占 32%，其中 G12C+、G12V+ 和 G13D+ 最為常見。所有患者的 KRAS ROC 曲線 AUC 值為 0.643，早期 CRC（I 期）患者為 0.649，晚期 CRC（II/III 期）患者為 0.625（?圖?2D-F）。此外，還評估了所有這些患者的 m3 細菌基因。結(jié)果表明，擴增 m3 基因△ct 值低于 15.22 的 64 例 m3 水平較高，介于 15.22—20.03 之間的 54 例，79 例 m3 基因△ct 值高于 20.3，表明 m3 基因表達量較低。所有患者 m3 的診斷表現(xiàn)為 0.824，早期 CRC（I 期）患者為 0.823，晚期 CRC（II/III 期）患者為 0.825（?圖 2G-I?）。此外，83 例檢出 DNA 甲基化，所有患者甲基化的 AUC 值為 0.778，早期 CRC（I 期）患者為 0.779，晚期 CRC（II/III 期）患者為 0.776（?圖 2J-L?）。從上述證據(jù)中發(fā)現(xiàn)，m3 在這 4 個指標中表現(xiàn)出最高的診斷表現(xiàn)，而 FIT 表現(xiàn)出最差的 AUC 值低于 0.6。單一生物標志物的診斷準確性。FIT（A-C）、KRAS（D-F）、m3（G-I） 和甲基化 （J-L） 診斷所有 CRC 患者以及早期或晚期 CRC 診斷的診斷準確率為 ROC 曲線。接下來，評估兩個變量隨機組合的診斷性能。如圖?3 所示，可以發(fā)現(xiàn)，兩種指標組合大多比單一生物標志物表現(xiàn)出更好的預測性能。FIT 和 KRAS 的組合在所有患者中表現(xiàn)出最低的 AUC 值 0.699，早期 CRC 患者為 0.696，晚期 CRC 患者為 0.719（圖 3A-C?）。因此，F(xiàn)IT 和 KRAS 的聯(lián)合治療更適合晚期 CRC 患者。值得注意的是，F(xiàn)IT 和 m3 的組合對診斷性能沒有增強，AUC 值為 0.824 等于單個 m3 診斷（圖?3D 與圖?2G），早期 CRC 患者的診斷性能為 0.823，晚期 CRC 患者的診斷性能為 0.825（圖 3E?、F).一旦將 KRAS 與 m3 聯(lián)合使用，所有患者的 AUC 值從 0.824 升高到 0.866，早期 CRC 患者為 0.878，晚期 CRC 患者為 0.825（圖 3G-I?），表明 m3 和 KRAS 的組合更適合早期 CRC 患者。當聯(lián)合甲基化與 FIT、KRAS 和 m3 時，所有患者的 AUC 值分別為 0.803、0.824 和 0.903（圖?3J、M、P）;對于 I 期 CRC，值分別為 0.779、0.829 和 0.909（圖?3K、N、Q），在甲基化與 FIT、KRAS 和 m3 相結(jié)合的晚期 CRC 中，值分別為 0.814、0.811 和 0.886（圖?3L、O、R）。綜上所述，甲基化和 m3 聯(lián)合治療早期 CRC 患者和晚期 CRC 患者的 AUC 值最高，診斷聯(lián)合標志物比單一標志物表現(xiàn)更好。兩個變量的隨機組合的診斷性能，按 ROC 范圍。（A-C）FIT 與 KRAS、（D-F）FIT 與 m3、（G-I）KRAS 與 m3、（J-L） 甲基化與 FIT、（M-O） 甲基化與 KRAS、（P-R） 甲基化與 m3 對所有 CRC 患者診斷、早期或晚期 CRC 診斷的診斷性能，以 ROC 曲線顯示。然后，對三個變量進行隨機積分進行 ROC 分析。觀察到，所有患者 FIT、KRAS 和 M3 整合模型的 AUC 值均為 0.864，與 KRAS 和 M3 聯(lián)合治療相比，AUC 值無改善;FIT、KRAS 和 M3 整合模型的 AUC 值在早期 CRC 中為 0.878，在晚期 CRC 中為 0.825（圖 4A-C?）。此外，結(jié)果表明，與任意兩個變量的組合相比，F(xiàn)IT、KRAS 和甲基化組合的診斷性能略有提高，AUC 值為 0.841，早期 CRC 為 0.829，晚期 CRC 為 0.842（圖 4D-F?）。有趣的是，F(xiàn)IT、M3 和甲基化組合的 AUC 值高于 FIT 加 M3 或 FIT 加甲基化組，而低于 M3 加甲基化的組合（圖?3、 4G）;FIT、M3 和甲基化組合的 AUC 值在早期 CRC 中為 0.909，在晚期 CRC 中為 0.886（圖 4H?、I）。值得注意的是，KRAS、M3 和甲基化組合具有最強的預測能力，AUC 值升至 0.920（置信區(qū)間：0.881-0.960），優(yōu)于任何成對組合（圖?4J）;該組合的 AUC 值最高，早期 CRC 為 0.931，晚期 CRC 為 0.886（圖 4K，L?）。結(jié)果表明，KRAS、M3 和甲基化整合模型對 CRC 早期診斷具有最大的潛在預測能力。ROC 曲線呈現(xiàn)的 3 個變量隨機組合的診斷準確性。（A-C）FIT、KRAS、m3 聯(lián)合、（D-F）FIT、KRAS 聯(lián)合甲基化聯(lián)合、（G-I）FIT、m3 聯(lián)合甲基化聯(lián)合、（J-L）KRAS、m3 聯(lián)合甲基化聯(lián)合治療所有 CRC 患者診斷、早期或晚期 CRC 診斷的診斷性能，均以 ROC 曲線顯示。隨后，結(jié)合 4 項指標從 ROC 曲線評估 AUC 值，結(jié)果顯示 AUC 值為 0.920（置信區(qū)間：0.880-0.960），與 KRAS、M3 和甲基化聯(lián)合建立的模型相比沒有明顯變化，表明當使用 KRAS、M3 和甲基化預測 CRC 時，F(xiàn)IT 可能對診斷性能沒有顯著貢獻（圖?5A);4 項指標組合顯示，早期 CRC 的 AUC 值最高為 0.931，晚期 CRC 為 0.886（圖 5B?、C）。考慮到 AUC 置信區(qū)間越小表明 AUC 值的可信度越高，KRAS、M3 和甲基化的組合比 4 個因素的組合具有更好的預測效率。此外，3 項指標的結(jié)合，從臨床及時性來看，適合 CRC 診斷。采用 ROC 曲線顯示 4 個變量整體組合的診斷性能。（A） FIT、KRAS、m3 和甲基化組合對所有 CRC 患者診斷的診斷性能。（B）FIT、KRAS、m3 和甲基化聯(lián)合治療 CRC 患者早期診斷的診斷性能。（C）FIT、KRAS、m3 和甲基化聯(lián)合治療晚期 CRC 患者診斷的診斷性能。綜上所述，與單變量標志物相比，F(xiàn)IT、KRAS、M3 和甲基化這 4 種 CRC 診斷標志物的組合顯示出更高的診斷準確性。KRAS、M3 和甲基化整合表現(xiàn)出最佳的診斷性能，并有可能作為 CRC 診斷的決策支持工具。然而，需要進行更多的大規(guī)模研究來驗證所開發(fā)的診斷平臺的臨床效用。
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