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大家好，這里是專注表觀組學十余年，領(lǐng)跑多組學科研服務的易基因。 近日，西北農(nóng)林科技大學博士后金妙函等為第一作者，陳玉林教授和王小龍教授為通訊作者，在國際知名期刊《Journal of Advanced Research》上發(fā)表題為“Efficient derivation of stable sheep embryonic stem cells opens a new avenue for agricultural and biomedical application”的研究論文。研究團隊建立了一種名為TePR（mTeSR PLUS培養(yǎng)基聯(lián)合WNT/β-catenin通路抑制劑IWR-1）的新型培養(yǎng)系統(tǒng)，首次實現(xiàn)綿羊胚胎干細胞系（Embryonic Stem Cells, ESCs）的長期穩(wěn)定培養(yǎng)。具體而言，通過整合綿羊胚胎發(fā)育各階段的多組學數(shù)據(jù)（包括Smart-seq2、ATAC-seq和WGBS），系統(tǒng)描繪了綿羊早期胚胎發(fā)育和ESCs多能性狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄組與表觀遺傳特征。易基因科技為本研究提供Smart-seq2、ATAC-seq和WGBS技術(shù)支撐，助力揭示綿羊ESCs獨特的轉(zhuǎn)錄特征、染色質(zhì)開放狀態(tài)和甲基化模式，為理解反芻動物早期發(fā)育和干細胞多能性調(diào)控機制提供重要見解。
標題：Efficient derivation of stable sheep embryonic stem cells opens a new avenue for agricultural and biomedical application（構(gòu)建高效穩(wěn)定的綿羊胚胎干細胞系，開啟農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學應用新途徑） 發(fā)表時間：2025年7月23日 發(fā)表期刊：Journal of Advanced Research（J Adv Res） 影響因子：IF13/Q1 技術(shù)平臺：Smart-seq2、ATAC-seq和WGBS（易基因金牌技術(shù)） 作者單位：西北農(nóng)林科技大學 DOI：10.1016/j.jare.2025.07.036
胚胎干細胞系（ESCs）可分化為所有成體細胞類型，在農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學領(lǐng)域具有變革性潛力。然而，綿羊穩(wěn)定ESCs的分離仍然具有挑戰(zhàn)性，限制其在進一步研究中的應用。本研究旨在通過簡化方案建立穩(wěn)定的綿羊ESCs，保留其多能性。通過含有IWR-1的培養(yǎng)系統(tǒng)（稱為TePR）從囊胚內(nèi)細胞團中分離綿羊胚胎干細胞。通過長期培養(yǎng)（>100代）、三胚層分化、轉(zhuǎn)錄組分析（E0-E6胚胎）和跨物種比較來評估多能性。其中，轉(zhuǎn)錄組學顯示TePR條件下分離培養(yǎng)的綿羊胚胎干細胞系（稱為TePR-sESCs）與8細胞/桑椹胚相似，且與綿羊基因組激活時間一致。此外，ATAC-seq揭示了其多能性基因（如POU5F1、NANOG）的染色質(zhì)可及性。WGBS鑒定出多能性相關(guān)區(qū)域的低甲基化。TePR-sESCs在長期培養(yǎng)后仍保持正常核型、核心多能性基因表達（如POU5F1、NANOG）和三胚層分化能力，且耐受多輪基因編輯（如mCherry敲入和MSTN基因敲除），為農(nóng)業(yè)育種和生物醫(yī)學研究提供重要工具。
圖形摘要
易小結(jié) 本研究不僅在綿羊胚胎干細胞領(lǐng)域取得了重要突破，還通過應用和拓展表觀基因組學和單細胞轉(zhuǎn)錄組學測序技術(shù)，為反芻動物干細胞研究、農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學應用以及表觀遺傳學研究提供了新的工具和方法。這些成果不僅具有重要的科學價值，還為未來相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了重要的參考和啟示。 易基因提供的Smart-seq2、ATAC-seq和WGBS等多組學整合技術(shù)支撐，不僅能夠獲得更全面的生物學信息，還能揭示不同組學層面之間的相互作用和調(diào)控機制。這一研究為未來多組學整合研究提供成功思路，展示了其在復雜生物系統(tǒng)研究中的巨大潛力。 易基因相關(guān)拓展性案例展示 l Cell｜易基因微量DNA甲基化測序助力中國科學家成功構(gòu)建胚胎干細胞嵌合體猴，登上《細胞》封面 l 項目文章 | 植入前胚胎的全基因組DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組分析揭示水牛胚胎基因組激活進展 l 項目文章｜微量WGBS+ACE-seq揭示卵巢早衰的人卵丘細胞DNA甲基化與羥甲基化表觀基因組圖譜 l 項目文章 | JGG：單細胞甲基化+轉(zhuǎn)錄組多組學分析揭示哺乳期母體低蛋白飲食對子代的跨代傳遞 l 項目文章：微量DNA甲基化分析揭示MeCP2在卵子發(fā)生和卵巢衰老中的表觀遺傳調(diào)控 l Nature | 易基因DNA甲基化測序助力人多能干細胞向胚胎全能8細胞的人工誘導
研究方法 胚胎收集與培養(yǎng)：從雌性綿羊體內(nèi)收集胚胎，并在體外培養(yǎng)至不同發(fā)育階段。 ESC的分離與培養(yǎng)：TePR條件下從囊胚內(nèi)細胞團中分離綿羊ESC，并進行長期培養(yǎng)。 轉(zhuǎn)錄組分析（Smart-seq2）：對綿羊植入前胚胎（卵母細胞至囊胚共7個階段）和ESC進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，分析其基因表達譜，揭示胚胎基因組激活（Embryonic Genome Activation, EGA）動態(tài)。 染色質(zhì)開放性分析（ATAC-seq）：比較TePR-sESCs與綿羊胎兒成纖維細胞（Sheep Fetal Fibroblasts, SFFs）的染色質(zhì)開放區(qū)域，識別多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合 motif（如POU5F1、SOX2）。 全基因組甲基化分析（WGBS）：對ESC和成纖維細胞進行WGBS，分析DNA甲基化模式，定位差異甲基化區(qū)域（DMRs）。 基因編輯：利用PiggyBac轉(zhuǎn)座和CRISPR/Cas9技術(shù)對ESC進行基因編輯，驗證其基因編輯能力。 嵌合體實驗：將ESC注入早期囊胚，觀察其在嵌合體胚胎中的貢獻。
結(jié)果圖形 （1）TePR培養(yǎng)基支持綿羊ESC系的構(gòu)建和長期穩(wěn)定培養(yǎng) 研究者測試了四種不同的培養(yǎng)條件（NBFR、bEPSCM、3i/LAF和TePR），發(fā)現(xiàn)TePR條件下的綿羊ESC（TePR-sESCs）能夠成功構(gòu)建并長期穩(wěn)定培養(yǎng)。TePR-sESCs展現(xiàn)出穩(wěn)定的形態(tài)，能夠在單細胞水平上傳代，并在超過100代后保持未分化狀態(tài)。這些細胞表達多能性標記基因（如POU5F1、SOX2和NANOG），并通過胚胎體（EB）分化實驗顯示出三胚層分化潛力。這些結(jié)果表明，TePR培養(yǎng)基能夠支持綿羊ESC的建立和長期穩(wěn)定培養(yǎng)，為后續(xù)研究提供可靠的細胞模型。
圖1：TePR-sESCs的生成與表征 (A) TePR-sESCs從第6天體內(nèi)受精胚胎中分離的示意圖。 (B) TePR-sESCs的明場圖像和堿性磷酸酶（AP）染色。 (C) TePR-sESCs的核型分析。 (D) 使用RT-qPCR分析TePR-sESCs的核心多能性基因（POU5F1、SOX2、NANOG、LIN28和SALL4）的基因表達。 (E) TePR-sESCs（P10）和TePR-sESCs（P100）的單細胞克隆效率。 (F) 體外胚狀體（EB）分化實驗。通過RT-PCR檢測外胚層（OTX2、PAX3、KRT8和NESTIN）、中胚層（PDGFRA和ACTA2）和內(nèi)胚層（FOXA2和GATA6）特異性基因的表達。 (G) 體內(nèi)畸胎瘤形成實驗。TePR-sESCs形成的畸胎瘤的H&E染色。 (H) 免疫染色檢測POU5F1、SOX2、NANOG、SSEA4、TRA-1–81和TRA-1–60。 (I) 免疫染色檢測AFP、GATA6、SMA、Nestin和Tublin。
（2）TePR-sESCs的轉(zhuǎn)錄組表征 通過單細胞轉(zhuǎn)錄組Smart-seq2分析顯示，綿羊EGA發(fā)生于8細胞期至桑椹胚階段。TePR-sESCs的轉(zhuǎn)錄組特征與8細胞/桑椹胚胚胎高度相似，但多能基因表達模式存在差異：如POU5F1在桑椹胚中高表達，而在TePR-sESCs中下調(diào)。差異表達基因（DEGs）富集于WNT/BMP信號通路、胚胎器官形態(tài)發(fā)生等，提示TePR-sESCs處于一種接近胚胎早期發(fā)育的多能狀態(tài)，這些結(jié)果揭示了TePR-sESCs獨特的轉(zhuǎn)錄組特征。
圖2：TePR-sESCs的轉(zhuǎn)錄特征分析 (A) 轉(zhuǎn)錄組測序示意圖。 (B) 樣本相關(guān)性熱圖（MII卵母細胞、受精卵、2細胞期、8細胞期、桑椹胚、早期囊胚、晚期囊胚以及TePR-sESCs）。 (C) 不同胚胎階段（MII卵母細胞、受精卵、2細胞期、8細胞期、桑椹胚、早期囊胚、晚期囊胚以及TePR-sESCs）的基因表達水平。 (D) TePR-sESCs與不同胚胎階段的主成分分析。 (E) 8細胞期胚胎、桑椹胚和TePR-sESCs中標記基因表達的箱線圖。 (F) 8細胞期胚胎與TePR-sESCs之間差異表達基因（DEGs）的火山圖。 (G) 8細胞期胚胎與TePR-sESCs之間差異表達基因（DEGs）的GO富集分析。 (H) 桑椹胚與TePR-sESCs之間差異表達基因（DEGs）的火山圖。 (I) 桑椹胚與TePR-sESCs之間差異表達基因（DEGs）的GO富集分析。
（3）TePR-sESCs的表觀遺傳表征 利用ATAC-seq和WGBS技術(shù)，研究者分析了TePR-sESCs的染色質(zhì)可及性和DNA甲基化模式。ATAC-seq結(jié)果顯示，TePR-sESCs的染色質(zhì)可及區(qū)域顯著多于成纖維細胞，且這些區(qū)域富含多能性轉(zhuǎn)錄因子（如POU5F1、SOX2和NANOG）的結(jié)合位點。WGBS結(jié)果顯示，TePR-sESCs的DNA甲基化水平約為82%，與人類、豬和牛的EPSCs相似。這些結(jié)果表明，TePR-sESCs具有獨特的表觀遺傳特征，這些特征可能與其多能性狀態(tài)密切相關(guān)。 ATAC-seq：TePR-sESCs的染色質(zhì)開放區(qū)域（DARs）顯著多于綿羊胎兒成纖維細胞（SFFs），且富集于多能基因啟動子區(qū)（如POU5F1、NANOG）（圖3A-D）。差異可及性基因參與cAMP/WNT信號通路（圖3E），表明表觀遺傳調(diào)控與多能性維持密切相關(guān)。 WGBS：TePR-sESCs全基因組甲基化水平約82%，與人類、豬和牛等物種的primed ESCs相似（圖3F）。DMRs主要位于基因間區(qū)和內(nèi)含子區(qū)，且與TSS鄰近區(qū)域的染色質(zhì)可及性呈負相關(guān)（圖3H），印證了DNA甲基化對基因表達的抑制作用。
圖3：TePR-sESC的表觀遺傳表征。 （A）TePR-sESC和SFF的總ATAC-seq水平。 （B）TePR-sESC和SFF之間不同基因組區(qū)域（啟動子、內(nèi)含子、編碼外顯子和遠端基因間區(qū)域）內(nèi)DAR分布。 （C）每個基因組區(qū)域中DAR豐度小提琴圖。 （D）TePR-sESCs和SFF中ATAC-seq peaks的motif富集分析。 （E）與SFF相比，TePR-sESC中富集具有不同染色質(zhì)可及性的基因通路。 （F）TePR-sESC和SFF的DNA甲基化水平。 （G）TePR-sESC和SFF之間不同基因組區(qū)域（啟動子、外顯子、基因間和內(nèi)含子區(qū)域）內(nèi)DMR的分布。（H）轉(zhuǎn)錄起始位點的平均DNA甲基化水平和DAR分布（TSS±3Kb）。
（4）TePR-sESCs的特異性基因網(wǎng)絡 通過整合多組學（DEGs+DARs+DMGs）數(shù)據(jù)，研究團隊鑒定出13個在TePR-sESCs中具有特異性表達模式基因（如PDE4D、SIX6、MECOM和TBX18）。這些基因在cAMP、MAPK、細胞間連接和Ras信號通路中富集。此外研究者還分析了TePR-sESCs與其他物種（豬、牛）ESC的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)TePR-sESCs與人類naive ESCs的表達模式最為接近。這些結(jié)果揭示了TePR-sESCs特異性的基因網(wǎng)絡特征，為研究綿羊胚胎發(fā)育和ESC多能性提供了新視角。
圖4：TePR-sESC的特定基因網(wǎng)絡特征 （A） 比較 TePR-sESC、pEPSC、bESC、hNaive ESC、hEPS 和 hPrimed ESC 的 PCA 分析。 （B）TePR-sESC、pEPSC、bESC、hNaive ESC、hEPS和hPrimed ESC的維恩。 （C）TePR-sESCs獨特表達基因的GO富集分析。 （D）TePR-sESCs和SFFs中印記基因的表達。 （E）TePR-sESCs和SFFs中組蛋白基因的表達水平。 （F）TePR-sESCs和SFFs的DMR、DAR和DEG重疊。
（5）WNT信號通路維持TePR-sESCs多能性 研究者發(fā)現(xiàn)，WNT信號通路抑制劑IWR-1對于維持TePR-sESCs的多能性至關(guān)重要。去除IWR-1會導致細胞形態(tài)改變、堿性磷酸酶（AP）染色減弱以及多能性標記基因表達下降，而用同類型抑制劑XAV939替代后不會影響細胞的多能性。這些結(jié)果強調(diào)了WNT信號通路在維持TePR-sESCs多能性中的關(guān)鍵作用。
圖5：WNT信號通路抑制劑維持TePR-sESCs的多能性 （A）比較IWR-1缺失和XAV939添加條件下培養(yǎng)的TePR-sESCs的形態(tài)與AP染色。 （B）qRT-PCR對多能性相關(guān)基因mRNA表達水平的定量分析。 （C）POU5F1、SOX2和NANOG的免疫熒光染色結(jié)果。
（6）TePR-sESCs實現(xiàn)精準基因編輯 研究者利用PiggyBac技術(shù)在TePR-sESCs中成功敲入mCherry基因，并通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除肌肉生長抑制素（MSTN）基因。Sanger測序和深度測序結(jié)果顯示，基因編輯效率高達93.9%和97.4%。Western blotting結(jié)果表明，編輯后的細胞不表達MSTN蛋白。此外，這些基因編輯后的細胞仍保持多能性。這些結(jié)果表明，TePR-sESCs能夠耐受多輪基因編輯，為農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學應用提供了強大的工具。
圖6：TePR-sESCs的基因編輯表現(xiàn) （A）基因編輯流程示意圖。 （B）mCherry標記的TePR-sESCs熒光圖像。 （C）MSTN基因敲除（MSTN-/-）的TePR-sESCs圖像。 （D）MSTN-/-TePR-sESCs的編輯效率統(tǒng)計。 （E）MSTN-/-TePR-sESCs的Western blotting檢測結(jié)果，驗證MSTN蛋白表達缺失。 （F）MSTN-/-TePR-sESCs中多能性基因的qRT-PCR分析。
結(jié)果和啟示 本研究通過整合Smart-seq2、ATAC-seq和WGBS技術(shù)，首次系統(tǒng)地描繪了綿羊早期胚胎發(fā)育和ESC多能性狀態(tài)的分子與表觀遺傳全景圖。研究揭示了綿羊ESC獨特的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳特征，并成功實現(xiàn)了基因編輯。這些結(jié)果不僅增進了我們對反芻動物早期發(fā)育和干細胞多能性調(diào)控機制的理解，還為未來的農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學研究提供了新的工具和方法。未來的研究可以進一步探索這些技術(shù)在其他物種中的應用，以揭示更多關(guān)于胚胎發(fā)育和干細胞多能性的奧秘。
關(guān)于易基因單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（smart-seq2） 10X Genomics公司Chromium解決方案無法滿足某些特殊或者微量細胞樣本甚至單細胞轉(zhuǎn)錄組研究。Smart-seq2技術(shù)在單細胞水平對帶Poly（A）的RNA進行全長轉(zhuǎn)錄組擴增及高通量測序，能夠滿足高靈敏度、低偏好性的cDNA擴增，得到全長轉(zhuǎn)錄本，實現(xiàn)高水平的序列模板轉(zhuǎn)換。 Smart-seq2技術(shù)有較好的覆蓋范圍，可檢測到稀有轉(zhuǎn)錄本，無需額外的專業(yè)設(shè)備，應用范圍較廣，可以解決傳統(tǒng) RNA 定量技術(shù)在早期胚胎發(fā)育、干細胞、癌癥、免疫等研究領(lǐng)域中存在的樣品量極低或細胞異質(zhì)性的問題，是在單細胞水平研究基因表達強有力的工具，極大地拓展了RNA-seq 的應用范圍。
技術(shù)優(yōu)勢： （1）起始量低：1-1000個細胞或10pg-10ng total RNA即可高效擴增； （2）轉(zhuǎn)錄本覆蓋度高：通過雙端引物擴增全長cDNA，獲得全轉(zhuǎn)錄組信息，避免3’端和5’端偏好性，產(chǎn)物完整性好； （3）檢測靈敏度高：大幅度增加了低表達基因的檢出量; （4）堿基分辨率高：可達單堿基分辨率，且可以定位到具體基因的具體轉(zhuǎn)錄本; （5）實驗可控：質(zhì)控點多，可從實驗的開端判斷細胞狀況。
研究方向： 可應用于細胞分子機制中細胞異質(zhì)性研究，解決因樣本量少而無法進行高通量測序的情況。 l 免疫學研究 l 腫瘤及微環(huán)境研究 l 繪制組織精細化表達圖譜 l 早期胚胎發(fā)育
關(guān)于易基因全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS） 全基因組重亞硫酸鹽甲基化測序（WGBS）可以在全基因組范圍內(nèi)精確的檢測所有單個胞嘧啶堿基（C堿基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金標準。WGBS能為基因組DNA甲基化時空特異性修飾的研究提供重要技術(shù)支持，能廣泛應用在個體發(fā)育、衰老和疾病等生命過程的機制研究中，也是各物種甲基化圖譜研究的首選方法。
易基因全基因組甲基化測序技術(shù)通過T4-DNA連接酶，在超聲波打斷基因組DNA片段的兩端連接接頭序列，連接產(chǎn)物通過重亞硫酸鹽處理將未甲基化修飾的胞嘧啶C轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏，進而通過接頭序列介導的PCR 技術(shù)將尿嘧啶U轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏。
應用方向： WGBS廣泛用于各種物種，要求全基因組掃描（不錯過關(guān)鍵位點） ? 全基因組甲基化圖譜課題 ? 標志物篩選課題 ? 小規(guī)模研究課題
技術(shù)優(yōu)勢： ? 應用范圍廣：適用于所有參考基因組已知物種的甲基化研究； ? 全基因組覆蓋：最大限度地獲取完整的全基因組甲基化信息，精確繪制甲基化圖譜； ? 單堿基分辨率：可精確分析每一個C堿基的甲基化狀態(tài)。
易基因染色質(zhì)可及性-轉(zhuǎn)座酶易接近染色質(zhì)測序（ATAC-seq） ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing）是通過使用高通量測序?qū)D(zhuǎn)座酶可接近性核染色質(zhì)區(qū)域進行分析的一種創(chuàng)新表觀遺傳學研究技術(shù)。該技術(shù)通過轉(zhuǎn)座酶對某種特定時空下開放的核染色質(zhì)區(qū)域進行切割，進而獲得在該特定時空下基因組中所有活躍轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列。 真核生物的DNA并不是裸露的，而是被包裝成核小體形成串珠狀結(jié)構(gòu)并進一步被折疊、包裝。而基因的轉(zhuǎn)錄，需要將這種高級結(jié)構(gòu)解開，使DNA成為可以使各種轉(zhuǎn)錄機器與其結(jié)合的裸露狀態(tài)，即形成開放染色質(zhì)區(qū)域。如何鑒定開放染色質(zhì)區(qū)域呢？傳統(tǒng)的方法主要是借助和DNase-Seq、MNase-Seq及ChIP-seq。但這些方法需要的起始細胞量較大，對于少量樣本和珍稀樣本可行性不高。ATAC-Seq是一種新型的研究開放染色質(zhì)的技術(shù)，利用Tn5轉(zhuǎn)座酶進入并切割裸露的DNA，并同時連接上特異性的測序接頭。因為切割和加接頭一步完成，因此該技術(shù)可大大降低所需細胞起始量。
技術(shù)優(yōu)勢： （1）所需細胞起始量低。 （2）應用范圍廣，適用于大部分物種及細胞類型。
實驗策略：
信息分析：
易基因除單細胞轉(zhuǎn)錄組學外，還專注提供全面的表觀基因組學（DNA甲基化、DNA羥甲基化、cfDNA）和表觀轉(zhuǎn)錄組學（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C、RNA與蛋白互作）、DNA與蛋白互作及染色質(zhì)開放性技術(shù)方案（ChIP-seq、ATAC-seq），更多表觀組學或多組學研究可關(guān)注易基因公眾號、網(wǎng)站、市場微信號等，期待與各位老師開展合作交流。詳詢易基因：0755-28317900。 參考文獻： Jin M, Huang S, Zhou S, Shen W, Cao J, Song S, Wei Y, Kalds P, Hua J, Ma B, Ross PJ, Wang X, Chen Y. Efficient derivation of stable sheep embryonic stem cells opens a new avenue for agricultural and biomedical application. J Adv Res. 2025 Jul 23. doi: 10.1016/j.jare.2025.07.036. 相關(guān)閱讀： 2. Nature | 易基因DNA甲基化測序助力人多能干細胞向胚胎全能8細胞的人工誘導 3. 項目文章：微量DNA甲基化分析揭示MeCP2在卵子發(fā)生和卵巢衰老中的表觀遺傳調(diào)控 4. 項目文章｜微量WGBS+ACE-seq揭示卵巢早衰的人卵丘細胞DNA甲基化與羥甲基化表觀基因組圖譜 5. 項目文章 | JGG：單細胞甲基化+轉(zhuǎn)錄組多組學分析揭示哺乳期母體低蛋白飲食對子代的跨代傳遞 6. 項目文章 | 植入前胚胎的全基因組DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組分析揭示水牛胚胎基因組激活進展 7. 項目文章｜JEM(IF10.6)：單細胞轉(zhuǎn)錄組測序(scRNA-seq)揭示過敏性肺部疾病的調(diào)控網(wǎng)絡 8. 項目集錦：微量樣本及單細胞DNA甲基化研究如何發(fā)高分SCI文章（特別適用珍稀樣本） 9. 項目文章 | Nat Commun：單細胞轉(zhuǎn)錄組測序揭示光療通過腦膜淋巴系統(tǒng)改善AD和衰老 10. 技術(shù)推介｜APOBEC-coupled epigenetic sequencing（ACE-Seq） 11. 技術(shù)推介｜單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（smart-seq2） |
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