阿爾茨海默?。ˋD）是一種神經(jīng)退行性疾病，其中β-淀粉樣蛋白（Aβ）斑塊會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激（OS）和神經(jīng)炎癥，導(dǎo)致記憶喪失。反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞也可能引發(fā)氧化應(yīng)激和神經(jīng)退行性變，通過星形膠質(zhì)細(xì)胞尿素循環(huán)中有毒代謝物的積累促進(jìn)阿爾茨海默病的發(fā)展。然而，分子氫（H?）對(duì)該循環(huán)的影響尚不明確。因此，我們研究了氫氣治療是否能減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性變和記憶喪失。將5xFAD小鼠（n=14）和野生型小鼠（n=15）隨機(jī)分為四組，分別用3%氫氣（H?）或溶媒處理60天。采用Morris水迷宮和Y迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠的認(rèn)知行為。此外，我們通過生化檢測(cè)測(cè)量小鼠海馬體和經(jīng)AβO處理的原代小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中氨和過氧化氫（H?O?）的水平。利用免疫組織化學(xué)（IHC）和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）評(píng)估Aβ、γ-氨基丁酸（GABA）以及炎癥標(biāo)志物的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)，氫氣處理顯著改善了5xFAD小鼠的認(rèn)知缺陷、氧化應(yīng)激、有毒代謝物積累以及炎癥標(biāo)志物升高的情況。這些結(jié)果表明，氫氣療法可減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞尿素循環(huán)中的有毒代謝物，從而減少阿爾茨海默病中的神經(jīng)退行性變和記憶喪失。

1. 引言

記憶障礙和神經(jīng)退行性變是阿爾茨海默?。ˋD）的病理生理學(xué)特征，該病主要發(fā)生在65歲及以上人群中，構(gòu)成了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。在阿爾茨海默病中，β-淀粉樣蛋白（Aβ）斑塊（即不溶性Aβ纖維和 tau 纏結(jié)的大量沉積）在大腦中積累時(shí)，會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激（OS）、炎癥和細(xì)胞凋亡，因此它們是阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵標(biāo)志物[1,2,3]。氧化應(yīng)激與神經(jīng)退行性疾?。òò柎暮Ｄ?、帕金森病和輕度認(rèn)知障礙）的發(fā)病有關(guān)。它會(huì)破壞神經(jīng)元脂質(zhì)膜，導(dǎo)致與DNA損傷相關(guān)的細(xì)胞死亡，并通過蛋白質(zhì)氧化機(jī)制進(jìn)一步刺激Aβ的積累[4]。這些作用會(huì)造成神經(jīng)元損傷，最終導(dǎo)致阿爾茨海默病相關(guān)的記憶喪失[5]和線粒體功能障礙[6,7,8]，并導(dǎo)致細(xì)胞色素氧化酶活性缺陷和鈣（Ca2?）信號(hào)改變[9,10,11]。同樣，促凋亡標(biāo)志物Bax可激活線粒體中的半胱天冬酶（如半胱天冬酶-3、-8和-9），通過凋亡促進(jìn)神經(jīng)退行性變[7]。氧化應(yīng)激可通過核因子κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）樞紐觸發(fā)神經(jīng)炎癥，導(dǎo)致神經(jīng)退行性變和阿爾茨海默病的發(fā)生[12]。

反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞也可能導(dǎo)致神經(jīng)退行性變和記憶喪失[13]。隨著氧化應(yīng)激和亞硝化應(yīng)激的增加，星形膠質(zhì)細(xì)胞成為“雙刃劍”，既具有神經(jīng)保護(hù)作用，又會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)毒性[14]。這種神經(jīng)毒性源于有毒代謝物的積累增加，從而增強(qiáng)了星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性。氨等有毒代謝物會(huì)激活星形膠質(zhì)細(xì)胞尿素循環(huán)，并觸發(fā)腐胺、過氧化氫（H?O?）和γ-氨基丁酸（GABA）的合成[15,16]。在阿爾茨海默病中，細(xì)胞內(nèi)積累的β-淀粉樣蛋白（Aβ）可通過自噬-溶酶體途徑清除，釋放出天冬氨酸等氨基酸，這些氨基酸進(jìn)入星形膠質(zhì)細(xì)胞尿素循環(huán)，在精氨琥珀酸合成酶1的作用下轉(zhuǎn)化為精氨琥珀酸。然后，在精氨琥珀酸裂解酶的催化作用下，精氨琥珀酸轉(zhuǎn)化為精氨酸。精氨酸酶1（ARG1）將精氨酸轉(zhuǎn)化為鳥氨酸，尿素作為廢物釋放。鳥氨酸在鳥氨酸脫羧酶1（ODC1）的作用下發(fā)生脫羧反應(yīng)生成腐胺，腐胺經(jīng)過一系列酶促轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生過氧化氫和氨作為副產(chǎn)物，最終生成γ-氨基丁酸。產(chǎn)生的氨與谷氨酸發(fā)生N-乙?；磻?yīng)，形成氨基甲酰磷酸。然后，鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（OTC）將氨基甲酰磷酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸。瓜氨酸也可轉(zhuǎn)化為精氨琥珀酸，從而使循環(huán)重復(fù)進(jìn)行[13,17,18]。過氧化氫作為一種關(guān)鍵的活性氧（ROS），γ-氨基丁酸則分別促成神經(jīng)退行性變和記憶障礙[18]。負(fù)責(zé)產(chǎn)生這些有毒代謝物的關(guān)鍵酶是精氨酸酶1、鳥氨酸脫羧酶1和鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶[19]。

Ju等人闡明了反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞雙重功能背后的分子機(jī)制，包括有益的尿素循環(huán)活性通路（可解毒Aβ分解代謝物）和有害的循環(huán)（會(huì)增加鳥氨酸脫羧酶1的表達(dá)，從而促進(jìn)有毒的過氧化氫、氨和γ-氨基丁酸的積累）[18]。星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增強(qiáng)可導(dǎo)致膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）水平過表達(dá)。膠質(zhì)纖維酸性蛋白作為一種新興的阿爾茨海默病診斷標(biāo)志物，其過表達(dá)標(biāo)志著星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡（也稱為星形膠質(zhì)細(xì)胞增生）[16]。

盡管對(duì)阿爾茨海默病的病理生理學(xué)進(jìn)行了廣泛研究，但目前尚無治愈方法[20]。膽堿酯酶抑制劑[21]、美金剛、侖卡奈單抗和多奈單抗等治療方法只能延緩阿爾茨海默病的進(jìn)展[22,23]。近年來，分子氫（H?）在多種疾?。òㄉ窠?jīng)退行性疾病）中顯示出療效[17,24,25,26]。氫氣能有效減輕氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡[27,28,29]。氫氣分子體積小，易于穿透細(xì)胞膜并穿過血腦屏障，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生作用[17,24,25,26]。在包括阿爾茨海默病在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病中，氫氣療法已被證明可通過選擇性減少活性氧以及調(diào)節(jié)炎癥和凋亡信號(hào)通路來減輕氧化應(yīng)激[27,30]。具體而言，富氫水與抑制NLRP3炎癥小體有關(guān)，NLRP3炎癥小體是先天免疫反應(yīng)的重要組成部分，已被證實(shí)與阿爾茨海默病相關(guān)[31]。此外，氫氣療法已被證明可調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和雌激素受體β，這兩種物質(zhì)對(duì)突觸可塑性和神經(jīng)元存活至關(guān)重要[32]。此外，在化學(xué)誘導(dǎo)的輕度認(rèn)知障礙模型中，有報(bào)道稱氫氣可增強(qiáng)空間記憶，并降低氧化應(yīng)激、Aβ、Bax和切割的半胱天冬酶-7水平[29]。盡管氫氣具有治療益處，但其對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞尿素循環(huán)代謝通路的影響仍有待探索。

因此，本研究旨在探討氫氣治療是否能減少星形膠質(zhì)細(xì)胞尿素循環(huán)中有毒代謝物的積累，從而減緩神經(jīng)退行性變和記憶喪失。我們假設(shè)，通過行為測(cè)試、生化檢測(cè)、蛋白質(zhì)印跡、免疫組織化學(xué)（IHC）、免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）和基因表達(dá)分析評(píng)估，氫氣可下調(diào)5個(gè)家族性阿爾茨海默?。?xFAD）小鼠模型中尿素循環(huán)中有毒代謝物的積累，減少神經(jīng)退行性變和記憶障礙。

2. 結(jié)果

2.1 吸入氫氣減輕5xFAD小鼠的記憶障礙

我們采用Morris水迷宮和Y迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估氫氣治療對(duì)5xFAD小鼠海馬依賴性空間學(xué)習(xí)和記憶障礙的影響。我們分析了Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期、路徑長度和經(jīng)過時(shí)間。在第2-5天（隱藏平臺(tái)）的測(cè)試中，我們觀察到與溶媒處理的小鼠相比，氫氣處理的5xFAD小鼠的逃避潛伏期縮短了1.4倍，路徑長度縮短了2.0倍（圖1A、B）。在第6天的測(cè)試中，與溶媒處理的小鼠相比，氫氣處理的5xFAD小鼠的逃避潛伏期縮短了6.0倍（p<0.001；圖1C），路徑長度縮短了3.0倍（p<0.001；圖1D）；此外，氫氣處理的5xFAD小鼠進(jìn)入目標(biāo)象限（即經(jīng)過時(shí)間）的次數(shù)是溶媒處理小鼠的6.0倍（p<0.01；圖1E），游泳模式進(jìn)一步說明了這一點(diǎn)（圖1F）。對(duì)于Y迷宮實(shí)驗(yàn)，我們分析了臂進(jìn)入頻率（圖1G）、總距離（圖1H）和自發(fā)交替百分比（圖1I）。與溶媒處理的小鼠相比，氫氣處理的5xFAD小鼠的自發(fā)交替百分比顯著增加了2.7倍（p<0.01）（圖1I）。

圖1. 小鼠行為測(cè)試結(jié)果。Morris水迷宮結(jié)果，包括（A）試驗(yàn)期間（第2-5天）的逃避潛伏期，（B）試驗(yàn)期間（第2-5天）的路徑長度，（C）測(cè)試試驗(yàn)（第6天）的逃避潛伏期，（D）測(cè)試試驗(yàn)（第6天）的路徑長度，（E）測(cè)試試驗(yàn)（第6天）的經(jīng)過時(shí)間，以及（F）游泳模式。Y迷宮測(cè)試結(jié)果：（G）臂進(jìn)入次數(shù)，（H）總距離，以及（I）自發(fā)交替。野生型小鼠和5xFAD小鼠用3%氫氣處理（每組n=7）。顯著性差異設(shè)定為*p<0.05，p<0.01，*p<0.001。H?，分子氫；5xFAD，5個(gè)家族性阿爾茨海默?。籛T，野生型。

2.2 氫氣減少AβO處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞中的氧化應(yīng)激并減輕神經(jīng)炎癥

氧化應(yīng)激增加和神經(jīng)炎癥是阿爾茨海默病的典型病理生理學(xué)特征[12]。為了評(píng)估氫氣在調(diào)節(jié)這些病理標(biāo)志物方面的治療效果，我們?cè)u(píng)估了AβO誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)活性氧水平、過氧化氫酶抗氧化酶活性和促炎細(xì)胞因子。氫氣處理顯著減弱了AβO刺激的原代小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生，與溶媒相比減少了1.2倍（p<0.05；圖2A）。此外，氫氣處理后過氧化氫酶活性增加了20%，盡管這一增加并不顯著（圖2B）。為了進(jìn)一步研究氫氣在AβO刺激的原代小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中的抗炎潛力，我們使用qRT-PCR定量了常見神經(jīng)炎癥標(biāo)志物腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的表達(dá)。我們觀察到與溶媒相比，腫瘤壞死因子-αmRNA水平顯著降低（p<0.05；圖2C），但白細(xì)胞介素-6表達(dá)的降低并不顯著（圖2D）。

圖2. 氫氣處理對(duì)體外阿爾茨海默病模型中氧化應(yīng)激和炎癥標(biāo)志物的影響。（A-D）經(jīng)氫氣和溶媒處理的Aβ誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞（2×10?個(gè)細(xì)胞/孔）中活性氧檢測(cè)、過氧化氫酶檢測(cè)、腫瘤壞死因子-αmRNA水平和白細(xì)胞介素-6的柱狀圖（每組n=3）。H?，分子氫；IL-6，白細(xì)胞介素-6；OS，氧化應(yīng)激；ROS，活性氧；TNF-α，腫瘤壞死因子-α。實(shí)心圓和紅色柱代表氫氣處理，空心圓和白色柱代表溶媒處理。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性設(shè)定為*p<0.05，p<0.01。

2.3. 氫氣降低5xFAD小鼠的氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥

我們還評(píng)估了氫氣處理對(duì)5xFAD小鼠海馬組織中細(xì)胞內(nèi)活性氧水平、過氧化氫酶抗氧化酶活性和促炎細(xì)胞因子的影響。我們發(fā)現(xiàn)了顯著的效果，與溶媒處理組相比，活性氧水平降低1.2倍（p<0.05；圖3A），過氧化氫酶活性增加1.4倍（p<0.01；圖3B）。與溶媒處理組相比，氫氣處理顯著抑制腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-6的mRNA表達(dá)，分別降低1.6倍（p<0.01）和1.3倍（p<0.05）（圖3C、D）。

圖3. 氫氣處理對(duì)體內(nèi)阿爾茨海默病模型中氧化應(yīng)激和炎癥標(biāo)志物的影響。（A-D）經(jīng)氫氣處理的小鼠中活性氧檢測(cè)（n=7）、過氧化氫酶檢測(cè)（n=4）、腫瘤壞死因子-αmRNA水平和白細(xì)胞介素-6的柱狀圖。野生型（n=3）和5xFAD（n=3）。5xFAD，5個(gè)家族性阿爾茨海默?。籋?，分子氫；TNF-α，腫瘤壞死因子-α；IL-6，白細(xì)胞介素-6；OS，氧化應(yīng)激；ROS，活性氧。實(shí)心圓和紅色柱代表氫氣處理，空心圓和白色柱代表溶媒處理。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性設(shè)定為*p<0.05，p<0.01。

2.4. 氫氣改善5xFAD小鼠和AβO誘導(dǎo)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的淀粉樣蛋白病理并減少有毒代謝物積累

淀粉樣蛋白斑塊可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞尿素循環(huán)，導(dǎo)致有毒代謝物積累，引發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞再激活、神經(jīng)退行性變和記憶喪失[18]。為了評(píng)估氫氣處理對(duì)淀粉樣蛋白病理、膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)以及有毒代謝物（過氧化氫、氨和γ-氨基丁酸）積累的影響，我們利用小鼠和星形膠質(zhì)細(xì)胞的海馬切片及裂解物進(jìn)行了免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)和生化檢測(cè)。我們首先分析了反映過氧化氫水平的活性氧水平，發(fā)現(xiàn)與溶媒處理的對(duì)照組相比，經(jīng)氫氣處理的AβO誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和5xFAD小鼠中活性氧水平顯著降低（圖2A和圖3A）。接下來，我們進(jìn)行了免疫組織化學(xué)檢測(cè)，觀察到在皮質(zhì)（CTX）中，膠質(zhì)纖維酸性蛋白中Aβ斑塊的積累減少2.8倍（p<0.001），在海馬CA1區(qū)（CA1）減少2.4倍（p<0.05），在齒狀回（DG）減少2.7倍，如圖4A、B所示。同樣，經(jīng)氫氣處理的AβO誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中γ-氨基丁酸水平顯著低于溶媒處理的細(xì)胞（p<0.001）；后續(xù)的免疫細(xì)胞化學(xué)分析證實(shí)了這一點(diǎn)（圖4C、D）。對(duì)氨濃度的測(cè)量顯示，體外氨濃度略有降低，如圖4E、F所示。

圖4. 氫氣處理后的有毒代謝物水平。 （A）小鼠腦切片的免疫組織化學(xué)共聚焦圖像。（B）β-淀粉樣蛋白信號(hào)強(qiáng)度圖（n=4）。（C）用于檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞中γ-氨基丁酸信號(hào)的免疫細(xì)胞化學(xué)圖像。（D）γ-氨基丁酸強(qiáng)度圖（n=4）。（E、F）圖表顯示體外和體內(nèi)檢測(cè)的氨濃度。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性設(shè)定為*p<0.05，*p<0.001。H?，分子氫；CTX，皮質(zhì)；CA1，海馬CA1區(qū)；DG，齒狀回；5xFAD，5個(gè)家族性阿爾茨海默病；GABA，γ-氨基丁酸；ICC，免疫細(xì)胞化學(xué)；IHC，免疫組織化學(xué)；VEH，溶媒；6E10陽性表示淀粉樣蛋白斑塊。箭頭表示淀粉樣蛋白斑塊，白色方框表示在顯微鏡下檢測(cè)的切片。

3. 討論

在本研究中，我們使用5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠和AβO誘導(dǎo)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，研究了小鼠暴露于3%氫氣60天以及星形膠質(zhì)細(xì)胞暴露于3%氫氣3小時(shí)后，氫氣處理對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞尿素循環(huán)代謝物和酶的影響。分析的主要發(fā)現(xiàn)如下：（1）我們觀察到，經(jīng)氫氣處理的5xFAD小鼠表現(xiàn)出顯著的記憶改善，這體現(xiàn)在Morris水迷宮測(cè)試中顯著增加的經(jīng)過時(shí)間百分比和Y迷宮測(cè)試中更高的自發(fā)交替百分比（分別見圖1E、I）。這些表明，與溶媒相比，吸入3%氫氣顯著改善了5xFAD小鼠的空間記憶和學(xué)習(xí)能力。（2）在AβO誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物和5xFAD小鼠中，氫氣處理降低了氧化應(yīng)激（即活性氧和過氧化氫酶活性）和炎癥標(biāo)志物水平，處理組和溶媒組之間存在顯著差異（圖2A-D和圖3A-D）。這些發(fā)現(xiàn)表明，氫氣療法通過其抗氧化活性降低過氧化氫水平，以及通過抗炎機(jī)制降低腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-6基因表達(dá)，從而降低氧化應(yīng)激和炎癥。因此，這表明在AβO誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和5xFAD小鼠中，氫氣通過減輕氧化應(yīng)激和下調(diào)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。觀察到的活性氧和促炎介質(zhì)的減少，凸顯了氫氣作為一種針對(duì)阿爾茨海默病進(jìn)展中氧化還原失衡和神經(jīng)炎癥的藥物的治療潛力。（3）處理組的有毒代謝物水平顯著低于溶媒組，其中Aβ斑塊（以6E10陽性信號(hào)數(shù)量為代表）和γ-氨基丁酸存在顯著差異（圖4A-E）。這些數(shù)據(jù)表明，氫氣處理減少了有毒代謝物的積累，包括Aβ、過氧化氫和γ-氨基丁酸，與溶媒相比，氫氣處理后這些物質(zhì)顯著減少。這表明氫氣處理后，由于膠質(zhì)纖維酸性蛋白水平降低（表明星形膠質(zhì)細(xì)胞增生減少），星形膠質(zhì)細(xì)胞功能得到增強(qiáng)。

抗氧化防御系統(tǒng)是氫氣發(fā)揮功效的關(guān)鍵，其上游受核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（Nrf2）調(diào)控[33]。在氧化應(yīng)激條件下，核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2在Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keap1）修飾后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并與抗氧化反應(yīng)元件的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。這種結(jié)合驅(qū)動(dòng)許多抗氧化酶（包括過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶）的轉(zhuǎn)錄和隨后的表達(dá)[34]。通過這些機(jī)制，核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2防止活性氧和活性氮物種對(duì)細(xì)胞的損傷，并維持氧化還原穩(wěn)態(tài)[35]。近年來，關(guān)于氫氣醫(yī)學(xué)應(yīng)用的研究有所增加，在臨床前模型和臨床受試者中采用了不同的氫氣給藥方法。這些方法包括吸入、攝入（溶解在水中）、靜脈注射和皮膚涂抹凝膠[36,37]。不同研究中氫氣的濃度各不相同。約1-4%的氫氣被認(rèn)為是安全的[36]，據(jù)報(bào)道，吸入3%的氫氣可改善阿爾茨海默病患者的認(rèn)知和彌散張量成像評(píng)分[38]。此外，觀察到吸入2%的氫氣可通過下調(diào)健康成年人的生物標(biāo)志物水平來降低患阿爾茨海默病的風(fēng)險(xiǎn)。這些研究加深了我們對(duì)氫氣治療效果的理解[36,39]。然而，劑量和給藥途徑的差異使得這些發(fā)現(xiàn)難以比較[36,38,39]。此外，這些研究缺乏隨機(jī)性[38]，迄今為止，還沒有人研究過氫氣在阿爾茨海默病模型中調(diào)節(jié)與星形膠質(zhì)細(xì)胞尿素循環(huán)相關(guān)的有毒代謝物的機(jī)制。

最近的研究[18,40]提出鳥氨酸脫羧酶1可作為阿爾茨海默病的合適治療靶點(diǎn)；然而，有研究表明，鳥氨酸脫羧酶1抑制劑二氟甲基鳥氨酸需要高劑量且具有毒性副作用[41,42]。此外，另一項(xiàng)研究報(bào)道，二氟甲基鳥氨酸處理組和對(duì)照組在鳥氨酸脫羧酶1抑制方面沒有顯著差異[43]。最近的一項(xiàng)研究提出，強(qiáng)直性γ-氨基丁酸可能靶向腦部疾病中的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，但需要進(jìn)一步的證據(jù)來支持這一假設(shè)[44]。我們的研究顯示，用3%氫氣處理5xFAD小鼠后，其學(xué)習(xí)和記憶能力得到改善，這可能是由于氧化應(yīng)激和炎癥標(biāo)志物減少所致，與早期研究的結(jié)果一致[37,38,39,45]。

過氧化氫作為一種主要的活性氧，是星形膠質(zhì)細(xì)胞尿素循環(huán)中產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝物；氫氣是過氧化氫的清除劑，從而減少神經(jīng)退行性變。通過清除過氧化氫來降低氧化應(yīng)激，可能是觀察到的Aβ水平降低的原因（圖4B），這與先前的研究結(jié)果一致[12,46,47]。此外，大腦中Aβ的積累可觸發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙和凋亡[12]。高水平的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化，導(dǎo)致Aβ形成[5]。我們的研究顯示，Aβ、氧化應(yīng)激（表現(xiàn)為活性氧減少和過氧化氫酶活性增加）以及腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-6等炎癥標(biāo)志物均有所減少，這表明神經(jīng)退行性變有所減輕；這增強(qiáng)了神經(jīng)元內(nèi)信號(hào)傳遞，并防止了阿爾茨海默病的惡化，正如小鼠記憶改善所顯示的那樣（圖1E、I）。氧化應(yīng)激的減少還意味著膠質(zhì)纖維酸性蛋白區(qū)域中Aβ的共定位減少（圖4A、B），這表明星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡減少，其功能得到改善。此外，γ-氨基丁酸作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在星形膠質(zhì)細(xì)胞尿素循環(huán)的最后一步產(chǎn)生，會(huì)導(dǎo)致阿爾茨海默病中的記憶障礙[17]。我們的結(jié)果顯示，γ-氨基丁酸水平降低（圖4D），這有助于經(jīng)氫氣處理的5xFAD小鼠的記憶改善。

然而，缺乏特定尿素循環(huán)中間產(chǎn)物和酶以及抗氧化防御通路上游標(biāo)志物（如核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2）的代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，限制了我們廣泛評(píng)估氫氣處理的完整代謝影響的能力。未來的研究納入整合蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析，對(duì)于描述氫氣介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞尿素循環(huán)調(diào)節(jié)的全部范圍至關(guān)重要。盡管如此，我們的發(fā)現(xiàn)表明，氫氣可抑制有毒尿素循環(huán)代謝物的積累，從而減輕阿爾茨海默病模型中的神經(jīng)退行性變和記憶喪失。

4. 材料和方法

4.1. 動(dòng)物和細(xì)胞培養(yǎng)模型

所有動(dòng)物均按照延世大學(xué)原州醫(yī)學(xué)院機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的指南進(jìn)行管理，該委員會(huì)批準(zhǔn)了本研究的倫理許可（倫理批準(zhǔn)號(hào)：YWC-240423-2）。使用5周齡的雄性和雌性小鼠（n=29），包括過度表達(dá)淀粉樣前體蛋白（APP）和早老素1（PSEN1）的轉(zhuǎn)基因5xFAD小鼠（n=14）[48,49]以及C57BL/6野生型（WT）小鼠（n=15）。5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠（RRID:MMRRC_034848-JAX）購自杰克遜實(shí)驗(yàn)室（美國緬因州巴爾港；庫存編號(hào)：008730）。通過將轉(zhuǎn)基因小鼠與F1 C57BL/6小鼠交配培育半合子品系，并使用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）確認(rèn)其基因型。用于基因分型的引物信息如表A2所示。小鼠被飼養(yǎng)在12:12小時(shí)光/暗周期的籠子里，可自由獲取食物和水。處理組（野生型，n=8；5xFAD，n=7）通過氫氣發(fā)生裝置（GOOTZ有限公司，韓國楊州市）吸入3%氫氣，持續(xù)60天。相比之下，溶媒處理組（野生型，n=7；5xFAD，n=7）接受正常通風(fēng)。野生型氫氣處理組有1只死亡。60天后，進(jìn)行行為測(cè)試，處死小鼠，取出其大腦并保存以供進(jìn)一步分析。通過勻漿20mg組織制備腦裂解物，并使用BCA測(cè)定法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。每個(gè)樣品標(biāo)準(zhǔn)化為5mg/mL蛋白質(zhì)。

為了進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，我們使用1日齡C57BL/6小鼠幼崽制備原代皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物。解剖大腦皮質(zhì)，將其切碎并分離為單細(xì)胞。然后，我們將細(xì)胞接種在0.1mg/mL聚-D-賴氨酸包被的培養(yǎng)板中。細(xì)胞在含有4.5g/L葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、10%熱滅活胎牛血清（SIGMA-ALDRICH，美國加利福尼亞州卡爾斯巴德）和5%青霉素-鏈霉素的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Gibco，英國佩斯利）中培養(yǎng)。培養(yǎng)的細(xì)胞在37°C、5%二氧化碳的濕潤條件下維持。三天后，用新鮮培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞，去除漂浮的細(xì)胞碎片，并更換培養(yǎng)基[50]。

然后，將原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物在單獨(dú)的6孔板（2×10?個(gè)細(xì)胞/孔）中培養(yǎng)，以進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。AβO會(huì)加速阿爾茨海默病的進(jìn)展[3]；因此，為了評(píng)估氫氣處理在AβO誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中的作用，其中一個(gè)培養(yǎng)板中的細(xì)胞用1μM AβO（rPeptide，美國佐治亞州沃特金斯維爾）誘導(dǎo)5天，并置于連接到氫氣發(fā)生裝置（GOOTZ有限公司，韓國楊州市）的FLUXLUK細(xì)胞處理室中，總時(shí)長為3小時(shí)，間隔30分鐘，氫氣濃度設(shè)定為3%。在另一個(gè)培養(yǎng)板中，用氫氧化銨（即溶媒）處理細(xì)胞，處理時(shí)間相同。AβO的制備方法是：將1%冰冷的氫氧化銨（NH4OH）加入分裝到1.5μL微量管中的Aβ單體中，并在-80°C下儲(chǔ)存直至需要使用。

體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)的處理持續(xù)時(shí)間不同，這是由于生物學(xué)背景和實(shí)驗(yàn)限制的差異。在小鼠模型中，需要延長60天的暴露時(shí)間，以模擬阿爾茨海默病樣病理的慢性進(jìn)展。相比之下，體外原代星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)環(huán)境壓力更敏感，特別是在非標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下（如FLUXLUK培養(yǎng)箱中）。因此，為了避免誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激或死亡，氫氣暴露被限制在總計(jì)3小時(shí)的短時(shí)間間隔內(nèi)，這是類似的體外抗氧化處理研究中常用的方法。這種短期暴露足以評(píng)估星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)AβO和氫氣處理的保護(hù)或調(diào)節(jié)反應(yīng)。

4.2. 行為學(xué)測(cè)試

記憶障礙是阿爾茨海默?。ˋD）的一個(gè)典型特征[20]。為了評(píng)估氫氣（H?）對(duì)5xFAD小鼠認(rèn)知行為的影響，我們采用Morris水迷宮和Y迷宮來評(píng)估其空間學(xué)習(xí)能力和短期記憶[51,52]。所有行為學(xué)測(cè)試均采用雙盲法，僅在數(shù)據(jù)分析完成后才揭盲。Morris水迷宮測(cè)試按照Bromley-Brits等人[53]發(fā)表的方法進(jìn)行。簡要來說，將每只小鼠小心放置在第一個(gè)象限中，讓其游泳并尋找可見的平臺(tái)。60秒內(nèi)未能找到平臺(tái)的小鼠會(huì)被輕輕引導(dǎo)至平臺(tái)，并在平臺(tái)上停留10秒。該操作對(duì)每只小鼠在所有象限中重復(fù)進(jìn)行，持續(xù)五天。從第2天到第5天，平臺(tái)被隱藏起來以評(píng)估空間學(xué)習(xí)能力。第6天，平臺(tái)被完全移除，將小鼠分別放置在距離目標(biāo)象限最遠(yuǎn)的象限中，讓其探索60秒。每只小鼠的逃避潛伏期和路徑長度由五次試驗(yàn)的平均值確定。使用攝像機(jī)（Panlab Harvard Apparatus，美國馬薩諸塞州霍利斯頓，Panlab SMART視頻跟蹤系統(tǒng)Smart 3.0，Harvard Apparatus）跟蹤并記錄小鼠的運(yùn)動(dòng)，隨后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析以評(píng)估其表現(xiàn)。在第六天，通過分析逃避潛伏期、路徑長度和經(jīng)過時(shí)間來評(píng)估空間記憶和學(xué)習(xí)能力。

在Y迷宮測(cè)試中，將小鼠單獨(dú)放置在迷宮中央（Jeongdo B&P有限公司，韓國首爾），迷宮有三個(gè)相同的臂（彼此成120°角），讓小鼠探索8分鐘。只有當(dāng)小鼠的四肢都進(jìn)入臂內(nèi)時(shí)，才記錄為一次進(jìn)入。我們使用上述視頻跟蹤方法，并分析臂進(jìn)入頻率和自發(fā)交替行為[52]。

4.3. 有毒代謝物水平的評(píng)估

Ju等人[18]報(bào)道，在正常情況下，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過尿素循環(huán)清除氨、γ-氨基丁酸（GABA）和過氧化氫（H?O?）等有毒代謝物。然而，在阿爾茨海默病中，這些代謝物會(huì)積累，引發(fā)氧化應(yīng)激（OS）、神經(jīng)炎癥和細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)退行性變和記憶喪失。我們通過生化檢測(cè)、免疫組織化學(xué)（IHC）和免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）研究了氫氣對(duì)這些有毒代謝物水平的影響。

4.3.1. 活性氧和抗氧化酶檢測(cè)

使用2,7-二氯熒光素二乙酸酯（DCF-DA）（EMD Millipore公司，中國北京）測(cè)量細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，特別是過氧化氫的水平。簡要來說，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，將10μL海馬裂解物（5mg/mL）和100μL 20μM DCF-DA分裝到96孔板中。然后將板在暗處孵育30分鐘。孵育后，使用DTX-880微孔板讀數(shù)儀（Beckam Counter公司，美國加利福尼亞州富勒）在488nm激發(fā)/525nm發(fā)射波長下測(cè)量熒光。對(duì)于體外實(shí)驗(yàn)，原代星形膠質(zhì)細(xì)胞在6孔板（2×10?個(gè)細(xì)胞/孔）中培養(yǎng)，并用1μM AβO（rPeptide公司，美國佐治亞州沃特金斯維爾）誘導(dǎo)5天，然后用3%氫氣或1%氫氧化銨處理3小時(shí)，并用1×磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）（Lonza公司，美國馬里蘭州沃克斯維爾）洗滌兩次；按照上述方法進(jìn)行熒光檢測(cè)。

使用Amplex Red過氧化氫酶檢測(cè)試劑盒（Invitrogen公司，美國加利福尼亞州卡爾斯巴德）定量抗氧化酶活性。過氧化氫酶分解過氧化氫，產(chǎn)生水和氧氣，從而防止細(xì)胞損傷[54]。因此，將25μL每個(gè)樣品（5mg/mL）和對(duì)照分別加入板上相應(yīng)的孔中。接下來，加入25μL 40μM過氧化氫溶液，并將內(nèi)容物在約25-37°C下放置30分鐘。然后我們加入50μL 100μM Amplex Red試劑/0.4U/mL辣根過氧化物酶，將板在37°C下孵育30分鐘。隨后，使用SpectraMax ABS Plus微孔板讀數(shù)儀（Molecular Devices公司，美國加利福尼亞州圣何塞）在560nm處測(cè)量吸光度。熒光變化計(jì)算為無過氧化氫酶對(duì)照的熒光減去樣品的熒光。

4.3.2. 氨檢測(cè)

為了定量AβO誘導(dǎo)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物和小鼠腦組織中的氨濃度，我們按照產(chǎn)品說明書使用氨檢測(cè)試劑盒（Sigma-Aldrich公司，美國密蘇里州圣路易斯）。使用蒸餾水和離心將細(xì)胞（2×10?個(gè)細(xì)胞/孔）或海馬裂解物（5mg/mL）制成均勻混合物。將上清液的pH值優(yōu)化至7-8，并將100μL該上清液放入比色杯中。向比色杯中加入L-谷氨酸脫氫酶溶液，充分混合，并在18-35°C下孵育5分鐘。然后，如上所述，使用微孔板讀數(shù)儀在340nm處測(cè)量吸光度。

4.3.3. 免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)

為了確定3%氫氣處理是否減少5xFAD小鼠海馬中Aβ的積累，我們按以下方法進(jìn)行免疫組織化學(xué)。將切除的小鼠大腦左半球用4%多聚甲醛在4°C下固定過夜，并在30%蔗糖中脫水2天。使用低溫切片機(jī)將海馬切成30μm的冠狀切片。切片在4°C下儲(chǔ)存；用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌，然后浸入封閉緩沖液（由5%山羊血清、0.1M磷酸鹽緩沖鹽水和0.3%Triton X-100組成）中1小時(shí)。接下來，將切片在含有一抗（Dako公司，美國加利福尼亞州卡平特里亞）的封閉緩沖液中，在4°C下振蕩孵育至第二天。然后用含有0.03%Triton X-100的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌三次以去除未結(jié)合的抗體，并在室溫下與二抗孵育1小時(shí)。重復(fù)洗滌，加入磷酸鹽緩沖鹽水中的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（1:1500稀釋）；隨后用熒光封片劑（Cell Signaling Technology公司，美國馬薩諸塞州丹弗斯）封片，并使其干燥。使用共聚焦顯微鏡和Zeiss LSM880顯微鏡（Zeiss公司，德國耶拿）拍攝熒光圖像。使用ImageJ軟件（1.41版本，美國國立衛(wèi)生研究院，馬里蘭州貝塞斯達(dá)）處理圖像。一抗和二抗的信息如表A2所示。

采用免疫細(xì)胞化學(xué)分析氫氣對(duì)γ-氨基丁酸積累的影響。簡要來說，用3%氫氣或溶媒處理的AβO誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15分鐘，并在腦脊液中反復(fù)洗滌（三次）。使用含有0.2%Triton X-100的磷酸鹽緩沖鹽水滲透固定的細(xì)胞，并在室溫下封閉1小時(shí)。然后將細(xì)胞與小鼠抗γ-氨基丁酸一抗（Millipore公司，澳大利亞維多利亞州貝斯沃特）在4°C下孵育1小時(shí)。接下來，將細(xì)胞與二抗和DAPI（Vectashield?，美國加利福尼亞州紐瓦克）孵育40分鐘。每次孵育后，用含有0.1%Triton X-100的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌三次。按照上述免疫組織化學(xué)的方法進(jìn)行成像和分析。

4.4. 炎癥基因的逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)分析

為了評(píng)估氫氣如何影響炎癥細(xì)胞因子基因的表達(dá)，我們對(duì)AβO誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞（2×10?個(gè)細(xì)胞/孔）和小鼠海馬裂解物（5mg/mL）進(jìn)行了逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）。首先，使用easy-BLUETM總RNA合成試劑盒（iNtRON Biotechnology公司，韓國城南市）從星形膠質(zhì)細(xì)胞和海馬裂解物中提取RNA。使用PrimeScriptTM第一鏈cDNA合成試劑盒（Takara公司，韓國首爾）將提取的RNA（標(biāo)準(zhǔn)化為1μg）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。cDNA文庫制備后，按照Kwak等人[55]描述的方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)。簡要來說，樣品一式三份制備，最終體積為10μL，包括1μL 10pM引物、2μL cDNA、5μL SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems公司，英國沃靈頓）和2μL無RNA酶水；這些樣品在QuantStudio 6 Flex實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems?，新加坡馬西嶺工業(yè)區(qū)路3號(hào)）中進(jìn)行分析。以GAPDH mRNA作為參照，使用2-??CT法確定折疊變化。本實(shí)驗(yàn)中使用的引物列于表A1中。

4.5. 統(tǒng)計(jì)分析

我們使用GraphPad Prism軟件（8版本；GraphPad Software公司，美國加利福尼亞州拉霍亞）分析數(shù)據(jù)。采用雙因素方差分析和多重比較檢驗(yàn)（Tukey事后檢驗(yàn)）檢測(cè)差異，顯著性水平設(shè)定為p<0.05。實(shí)驗(yàn)樣品的數(shù)據(jù)以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示。除非圖注中另有說明，否則個(gè)體小鼠或培養(yǎng)細(xì)胞批次以單個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)和樣本表示。

5. 結(jié)論

我們的研究結(jié)果表明，氫氣處理有效減輕了AβO誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和5xFAD轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠模型中有毒代謝物、氧化應(yīng)激和炎癥標(biāo)志物的積累。此外，3%氫氣給藥降低了星形膠質(zhì)細(xì)胞尿素循環(huán)的有毒副產(chǎn)物過氧化氫和γ-氨基丁酸的水平，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。這些生化指標(biāo)的改善與認(rèn)知能力的增強(qiáng)相關(guān)，5xFAD小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力提高證明了這一點(diǎn)。據(jù)我們目前所知，這是第一項(xiàng)探索氫氣在阿爾茨海默病模型中靶向星形膠質(zhì)細(xì)胞尿素循環(huán)內(nèi)有毒代謝物積累的治療潛力的研究。這些發(fā)現(xiàn)表明，氫氣可能通過調(diào)節(jié)阿爾茨海默病中星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的代謝功能障礙，成為一種新型且有前景的減輕神經(jīng)退行性變的策略。盡管如此，仍需要詳細(xì)的蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析來闡明氫氣對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞尿素循環(huán)中間產(chǎn)物和酶的影響。

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