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本期內容是二代測序即NGS又稱為高通量測序，內容包括二代測序的平臺、儀器、技術參數(shù)，如何去判斷測序數(shù)據(jù)質量等。如果大家后續(xù)有測序需求，也可以判斷一下測序公司的質量和專業(yè)性。 一、二代測序介紹 常見的二代測序有常規(guī)轉錄組、單細胞轉錄組、宏基因組、擴增子、時空組等等。從研究方向看涉及的領域還是比較多的，但底層技術都是二代測序。簡單來說，二代測序技術就是在DNA復制過程中通過捕捉新添加的堿基所攜帶的特殊標記來確定DNA的序列，一般為熒光分子標記。 目前市面上的測序公司用的主要測序平臺有illumina和華大智造，比如說illumina的novaseq6000、Xplus，小通量的有miniseq、miseq，測序公司可能用高通量儀器比較多。華大平臺的有DNBseq-G99、DNBseq-T1、T7等等。這里給大家總結了幾款儀器的技術參數(shù)，包括讀長、通量、運行時間、技術特點、適用場景（內容參考的是平臺官方的說明書）。  二、如何判斷測序數(shù)據(jù)質量 1.Phred score/Q值 它是用來衡量測序堿基識別準確性的關鍵指標，通常以Q來表示，比如說Q20、Q30、Q40，我們常見的 Q30 > 80%，其中 Q30 就是表示堿基識別錯誤概率為 10?3，也就是 0.1% ，這就意味著正確率是 99.9% 。計算公式如下：  P表示堿基識別錯誤的概率，并不是直接測量值，是通過測序儀的信號強度統(tǒng)計模型推導得出，比如說熒光信號，假設某個位點的信號強度為：A=9000, T=30, C=30, G=40。堿基A是當前位點的正確堿基，則其他信號（T/C/G）就可能由噪聲或交叉干擾產生。此時P=錯誤信和之和/總信號之和，即（30 30 40）/（9000 30 30 40）= 0.01。 Phred score的值一般和儀器本身、測序方法比如說是單端測序還是雙端測序、還和測序的讀長有關，以下是illumina novaseq 6000和華大DNBseq-G99的質量分數(shù)：    可以理解為基因組中每個堿基被測序到的平均次數(shù)，也就是將基因組測了幾遍。比如某樣本的測序深度為50X，意思就是這個樣本基因組上每一個堿基平均被測序了30次。如果就數(shù)據(jù)量來說的話，某基因組大小是3G，測序深度是30X，那么最終得到的數(shù)據(jù)量就是3X30=90G。測序深度不夠會引發(fā)很多問題，包括對低頻突變的漏檢也就是假陰性率高，比如說在30×深度下，2%突變可能僅被0.6條reads覆蓋，無法進行確認，容易被誤認為測序噪聲。同樣的測序深度不夠也會造成假陽性，把隨機測序錯誤誤認為是真實變異。這就像是我們計算硬幣正反面概率，那次數(shù)肯定是越多越好，無限多次拋硬幣，得到的概率結果才更趨于真實概率。測序深度一般是和我們的樣本質量、檢測目的、數(shù)據(jù)分析要求有關。 即adapter污染率，上機測序的文庫序列結構中是包含有接頭序列的，比如說單細胞中cDNA文庫的序列構成：  黑色片段即為測序接頭。接頭涉及到具體的測序原理，后期內容再出。接頭污染會對數(shù)據(jù)造成多種影響。比如，降低比對率，因接頭序列無法比對到參考基因組，導致有效數(shù)據(jù)比例下降。此外，還會增加假陽性變異，因接頭序列可能被誤認為變異，導致假陽性結果。兩個平臺的接頭污染率根據(jù)其官方文件及相關文獻中的數(shù)據(jù)顯示列表：  即標簽跳躍或錯配，指的是在測序的過程中，樣本的index標簽錯誤地分配到其他樣本上，導致數(shù)據(jù)混淆和錯誤分配。index在單細胞的視頻里面提到過，可以理解為是樣本的標簽，index hopping會造成特定類型錯比對，導致文庫不能比對到預期標簽而是被錯誤地比對到另一個標簽上。index hopping率越高，數(shù)據(jù)質量相對就較差。 兩個平臺的indexhopping率根據(jù)其官方文件及相關文獻中的數(shù)據(jù)顯示列表：  提供幾篇對不同平臺數(shù)據(jù)進行對比的文獻  此外，還有比對率、重復率、GC含量偏差、隨機錯誤率等等指標沒有展開說，感興趣的話可以評論區(qū)告訴我。 |
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