選購之前客戶需要根據(jù)待標記物的分子量大小和標記量選擇最適宜的型號

產(chǎn)品介紹：

本生物素快速標記試劑盒提供了生物素快速標記所需全部試劑，用于含有伯氨基（NH2-）的蛋白/抗體/多肽或者其他大分子的標記。其反應(yīng)原理如下:

產(chǎn)品特點：

l   使用方法簡單，無需額外準備試劑；

l   節(jié)約時間，整個過程僅需 90min；

l   通過離心脫鹽和去除游離的生物素，無需透析或者凝膠過濾；

l   既可用于微量標記又可大量標記，每次可標記 0.2-2mg；

l   本試劑盒對于標記好的分子可以測試生物素標記效率，避免額外購買標記效率檢測試劑盒

生物素標記使用量的計算：

每個反應(yīng)中生物素試劑的使用量取決于待標記蛋白質(zhì)的量和濃度。例如，通過我們實驗數(shù)據(jù)分析表明，標記2mg/ml 的抗體（IgG ，150KD），使用生物素和抗體的分子比為 20:1 能達到最佳效果；其他蛋白的標記可以根據(jù)實際情況，參照此比例類推。

計算公式如下：

其中：

V(μL)為生物素的體積；                           V1(mL)為待標記物（蛋白/抗體/其他含有伯胺-NH2的大分子）；

   C1(mg/mL)為待標記物的濃度；                    R 為生物素與待標記物的分子比例；

   M為待標記物的分子量（道爾頓，Dalton，Da）      C(mM)為生物素的濃度

計算示例：我們將生物素配置成10mM的濃度，用來標記1mL的2mg/mL 的抗體（IgG ，150KD），準備加入的生物素與抗體的比例為20:1，那么帶入公式計算

⁶=26.66uL

實驗前準備：

1.按照生物素標記使用量的計算的公式計算所需要的生物素的量。

2.提前 20min 從冰箱中取出試劑盒，使試劑盒各組分平衡至室溫。

3.用助溶劑DMSO將活性生物素配制成10mM(2mg生物素加DMSO 440ul)。

 特別提示：

A.溶解的活性生物素建議一次性使用完，如使用不完可以密封放在-20℃的冰箱內(nèi)，一月內(nèi)可以使用，但是標記效率會降低；

B.生物素助溶劑使用完之后需要立即密封保存，防止吸潮。

操作步驟：（本操作步驟按照 1mg抗體的量進行標記）

1.   取1mg 待標記抗體于超濾管中，并加入相應(yīng)體積的標記緩沖液，使抗體的終濃度為 2mg/mL，12,000 x g 離心 10min。

請注意：

A.超濾管的最大體積和最大截留分子量，本實例超濾管的最大體積為 0.5mL；

B.如果待標記抗體濃度低時，可先超濾離心濃縮；

C.如果待標記物含有游離的氨基（Tris,氨基酸或者其他干擾物，需要用標記緩沖液反復(fù)超濾確保其去除干凈）

2. 加入13.3μL生物素溶液和適量標記緩沖液至上述超濾管中，使終體積為 0.5ml，并輕輕吹打混勻。放入 37℃恒溫箱中避光溫育 30min。

3. 12,000 x g 離心 10min。

4. 加入適量標記緩沖液至上述超濾管中，并輕輕吹打混勻，12,000 x g 離心 10min， 重復(fù)此步驟多次。

5. 收集超濾管中的溶液（即生物素標記的抗體），加入等體積保存液，-20℃保存。

生物素標記的抗體測量標記效率（微孔酶標板法）：

A.      取180uL HABA- Avidin混合液放入微孔板中，在500nm波長測量吸光值，記錄為A_500(H-A);最好測量三次取平均值；

B.       在微孔板中加入20uL待測的生物素標記蛋白（Biotinylated Protein,簡稱BP），震蕩或移液器吹打充分混勻后，在500nm波長測量吸光值，吸光值穩(wěn)定20秒以上，記錄為A_500(H-A-BP);最好測量三次取平均值；如果A_500(H-A-BP)< 0.3*A_500(H-A),請用PBS稀釋待測樣品，再次重復(fù)此步驟。

標記效率計算方法：

1）蛋白摩爾濃度計算：mM /mL

2）生物素摩爾濃度計算（微孔板法）：mM /mL

其中吸光值變化(微孔酶標板)：ΔA₅₀₀=A_500(H-A)- A_500(H-A-BP)

備注：使用標準96孔微孔板，200ul液體，其液面高度（光程）為0.58cm

4）標記摩爾比計算：

生物素：蛋白=[(生物素摩爾濃度*10)/蛋白原始摩爾濃度]*稀釋倍數(shù)

注意事項：

1. 本試劑盒也可標記其它含有氨基（NH2-）的抗原、HRP、多肽，具體標記比例根據(jù)待標記物中氨基的數(shù)量確定。

2. 本試劑盒中的生物素助溶劑為DMSO ，使用完畢后要密封干燥保存。

3. 本試劑盒未開封前的有效期為18個月，請在有效期內(nèi)使用;本試劑盒中的生物素加入助溶劑之后，如果使用不完，請密封放在-20℃保存，一周內(nèi)可以正常使用，如果超過一周，一個月之內(nèi)使用，使用里量請酌情加大；超過一個月請不要再使用。

4. 請注意試劑盒中提供的超濾管的規(guī)格和分子截流大小來確定是否適合您的最佳標記條件；

5. 在步驟 2 中，標記其它抗體時，我們最好控制抗體的終濃度為 2mg/mL，然后再根據(jù)抗體的量計算應(yīng)加入活性生物素的體積。

*本試劑僅供實驗室研究使用