論文上線截圖

衰老是生理退化、慢性疾病增加和年齡特異性死亡率的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。衰老的一個(gè)主要標(biāo)志是細(xì)胞衰老的慢性積累，這是一種對(duì)各種損傷刺激做出反應(yīng)的永久性細(xì)胞周期停滯狀態(tài)。細(xì)胞衰老損害了組織再生的能力，并推動(dòng)慢性低度炎癥，這加劇了衰老過(guò)程。清除衰老細(xì)胞有望減少慢性、低度炎癥，并提高組織修復(fù)能力，從而減輕老年生物體身體功能的下降。然而，選擇性且有效地清除不同類型細(xì)胞的衰老細(xì)胞是具有挑戰(zhàn)性的。在這里，作者開(kāi)發(fā)了一種前藥策略，設(shè)計(jì)了一種基于溶酶體β-半乳糖苷酶（β-gal）活性增加的新化合物。前藥SSK1被β-gal激活，并獨(dú)立于衰老誘導(dǎo)劑和細(xì)胞類型，消除小鼠和人類的衰老細(xì)胞。在老年小鼠中，有效地清除了不同組織中的衰老細(xì)胞，減少了衰老和年齡相關(guān)基因特征，減輕了低度局部和全身炎癥，并恢復(fù)了身體功能。結(jié)果表明，溶酶體β-gal可以有效地選擇性地消除衰老細(xì)胞，為開(kāi)發(fā)抗衰老干預(yù)措施提供一種新策略。

1.設(shè)計(jì)SSK1選擇性殺死衰老細(xì)胞

為了設(shè)計(jì)一種溶酶體β-半乳糖苷酶響應(yīng)的前藥，作者首先篩選了一系列FDA批準(zhǔn)的藥物，最終選擇吉西他濱，一種對(duì)衰老細(xì)胞具有強(qiáng)大細(xì)胞毒性的化合物作為最終產(chǎn)物。因?yàn)樗行У厍覐?qiáng)有力地殺死了小鼠和人類的衰老細(xì)胞（圖1a）；它的4-氨基基團(tuán)是前藥開(kāi)發(fā)中一個(gè)已經(jīng)確立的位點(diǎn)；由于其血漿循環(huán)時(shí)間短，它顯示出降低的系統(tǒng)毒性。并合成衰老特異性殺傷化合物1（SSK1）（圖1b）。作者還驗(yàn)證了前藥SSK1在衰老細(xì)胞中被特異性切割以釋放細(xì)胞毒性的吉西他濱而不是非衰老細(xì)胞中（圖1c）。這些結(jié)果表明SSK1對(duì)衰老細(xì)胞有毒，對(duì)非衰老細(xì)胞無(wú)毒。

為了測(cè)試SSK1選擇性殺死衰老細(xì)胞的能力，作者用SSK1處理了小鼠原代成纖維細(xì)胞及其復(fù)制誘導(dǎo)的衰老對(duì)應(yīng)物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SSK1選擇性地且強(qiáng)有力地消除了β-半乳糖苷酶陽(yáng)性的衰老細(xì)胞（圖1d），降低編碼β-半乳糖苷酶的基因GLB1的表達(dá)，損害了SSK1殺死陽(yáng)性衰老細(xì)胞的能力（圖1e），表明其對(duì)衰老細(xì)胞的特異性取決于溶酶體β-半乳糖苷酶活性。總的來(lái)說(shuō)，作者利用溶酶體β-半乳糖苷酶，這一衰老細(xì)胞的共同特征，設(shè)計(jì)了一種前藥，專門殺死衰老細(xì)胞。

接下來(lái)，作者探索了SSK1在衰老細(xì)胞中的分子機(jī)制。發(fā)現(xiàn)SSK1可以在衰老細(xì)胞中被處理成吉西他濱并激活p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路。因此，SSK1通過(guò)激活p38 MAPK信號(hào)通路殺死衰老細(xì)胞。此外，SSK1能夠激活caspase 3，這表明SSK1通過(guò)誘導(dǎo)凋亡殺死衰老細(xì)胞（圖1g）。這些結(jié)果表明，前藥SSK1被溶酶體β-半乳糖苷酶激活，并通過(guò)激活p38 MAPK和誘導(dǎo)凋亡選擇性地殺死衰老細(xì)胞。

圖1. SSK1的設(shè)計(jì)及其選擇性殺傷衰老細(xì)胞能力的驗(yàn)證

2. SSK1以更廣泛的方式殺死衰老細(xì)胞

接著作者測(cè)試了SSK1對(duì)小鼠和人類衰老細(xì)胞的特異性。首先，作者用SSK1處理了由電離輻射、致癌基因（KrasG12V）過(guò)表達(dá)或基因毒性應(yīng)激（依托泊苷處理）誘導(dǎo)的衰老的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）。這些由不同刺激誘導(dǎo)的衰老細(xì)胞被SSK1選擇性殺死，而非衰老細(xì)胞大多未受影響（圖2a）。其次，作者發(fā)現(xiàn)與非衰老對(duì)應(yīng)細(xì)胞相比，SSK1能選擇性地殺死成年小鼠復(fù)制誘導(dǎo)的衰老肺成纖維細(xì)胞（圖2b）。為了了解SSK1在不同物種間的效能差異，作者用SSK1處理了由不同刺激誘導(dǎo)的衰老的人類胚胎成纖維細(xì)胞（HEFs）。結(jié)果表明，SSK1選擇性清除了由不同應(yīng)激誘導(dǎo)的人類衰老細(xì)胞，且呈劑量依賴性，對(duì)非衰老細(xì)胞沒(méi)有明顯影響（圖2c）。作者還用SSK1處理人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）和人類前脂肪細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與非衰老細(xì)胞相比，衰老細(xì)胞被SSK1選擇性殺死（圖2d）。總的來(lái)說(shuō)，結(jié)果表明SSK1選擇性地殺死了小鼠和人類的衰老細(xì)胞，且與細(xì)胞類型和衰老刺激無(wú)關(guān)。

                                   圖2. SSK1以更廣泛的方式殺死衰老細(xì)胞 

3.SSK1減少肺部損傷小鼠中的衰老細(xì)胞

接下來(lái)，作者檢驗(yàn)了SSK1對(duì)體內(nèi)衰老細(xì)胞的影響。采用兩種獨(dú)立的體內(nèi)衰老模型：應(yīng)激誘導(dǎo)的衰老和自然發(fā)生的衰老。通過(guò)腹腔注射給這些肺部受損的小鼠注射載體或SSK1（圖3a），發(fā)現(xiàn)與載體處理的肺部受損小鼠相比，SSK1顯著減少了肺部SA-β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞的比例，SSK1處理組的肺組織中衰老相關(guān)基因的表達(dá)顯著降低（圖3b-e）。以上結(jié)果表明SSK1能夠消除SA-β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞，并減少體內(nèi)的衰老相關(guān)標(biāo)記物，為緩解衰老相關(guān)的肺損傷提供一種潛在的方法。

                圖3. 在博萊霉素誘導(dǎo)的肺損傷模型中SSK1可消除SA-β- goal陽(yáng)性衰老細(xì)胞

4.SSK1減輕老年小鼠中與衰老相關(guān)的分泌表型（SASP）和年齡相關(guān)標(biāo)志

為了進(jìn)一步檢驗(yàn)SSK1對(duì)老年小鼠中自然發(fā)生的衰老細(xì)胞的影響，作者對(duì)20個(gè)月大的C57BL/6小鼠間歇性地用SSK1、吉西他濱或載體處理8周（圖4a）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與載體和吉西他濱相比，SSK1減少了老年小鼠肝臟、腎臟和肺組織中的SA-β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞，降低了老年小鼠中其他衰老標(biāo)記物的表達(dá)（圖4b- g）。這些結(jié)果表明SSK1減少了自然積累的衰老細(xì)胞，并降低了小鼠中的衰老標(biāo)記物。

衰老細(xì)胞分泌一系列炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、蛋白酶和其他因素，統(tǒng)稱為SASP。SASP有助于衰老期間局部和全身低度炎癥，與年齡相關(guān)的退行性表型，以及身體功能的損害。作者發(fā)現(xiàn)SSK1減輕了老年肝臟和腎臟中與SASP相關(guān)基因的表達(dá)模式，下調(diào)了與炎癥反應(yīng)、TNFα/NF-κB信號(hào)通路、IL6/JAK/STAT3信號(hào)軸和補(bǔ)體系統(tǒng)相關(guān)的基因，趨向于年輕對(duì)應(yīng)水平,降低了老年肝臟和腎臟中的年齡相關(guān)標(biāo)志（圖5a-j）。結(jié)果表明，SSK1清除衰老細(xì)胞有助于緩解老年小鼠中的年齡相關(guān)標(biāo)志。

                   圖4. SSK1在衰老小鼠中刪除衰老細(xì)胞并減弱衰老相關(guān)特征  

                              圖5. SSK1在老年小鼠中減弱SASP和衰老相關(guān)信號(hào)  

5. SSK1改善老年小鼠的身體功能

由于SSK1減少了局部和全身的慢性炎癥，作者進(jìn)一步測(cè)試了SSK1處理的老年小鼠的功能改善。通過(guò)一系列功能測(cè)試評(píng)估它們的身體表現(xiàn)，這些小鼠功能測(cè)試的結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)功能、平衡能力、運(yùn)動(dòng)耐力、骨骼肌容量和自發(fā)探索能力得到了改善（圖6a-e）。總的來(lái)說(shuō)， SSK1在改善老年小鼠的身體功能方面更有效。

                                         圖6. SSK1改善老年小鼠的身體機(jī)能   

                                                                    結(jié)論

  

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