看了我們上期的介紹，你應(yīng)該已經(jīng)了解在 Cre 工具鼠中 Cre 重組酶上游的啟動(dòng)子決定了 Cre 在哪種組織或細(xì)胞類型中表達(dá)，這是基因敲除的空間特異性。那么條件性基因敲除的時(shí)間特異性又是怎么實(shí)現(xiàn)的呢？

今天我們就來(lái)說(shuō)一說(shuō)基因敲除的時(shí)間控制。

誘導(dǎo)型 Cre-loxP 系統(tǒng)介導(dǎo)了時(shí)間特異性基因敲除。通過(guò)對(duì)給予誘導(dǎo)劑的時(shí)間的控制，人為操控基因敲除的發(fā)生。

誘導(dǎo)型 Cre 有哪幾種類型？

啟動(dòng)子激活型

通過(guò)誘導(dǎo)劑來(lái)調(diào)節(jié)驅(qū)動(dòng) Cre 重組酶的啟動(dòng)子活性。

例如：四環(huán)素誘導(dǎo)型、干擾素誘導(dǎo)型

配體誘導(dǎo)型

通過(guò)將 Cre 重組酶與激素受體的配體結(jié)合域（ligand-binding domain，LBD）相融合，形成定位于胞漿的融合蛋白，只有在激素誘導(dǎo)后，融合的 Cre 蛋白才會(huì)通過(guò)構(gòu)象變化從錨定蛋白 HSP90 上解離下來(lái)，進(jìn)入細(xì)胞核，識(shí)別 loxP 位點(diǎn)并發(fā)生重組。

例如：雌激素誘導(dǎo)型

下面我們一一道來(lái)

1. 四環(huán)素誘導(dǎo)型 tetO-Cre

將四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)與 Cre-loxP 系統(tǒng)相結(jié)合，一般需要兩種轉(zhuǎn)基因小鼠交配使用：

· 一種是由四環(huán)素響應(yīng)啟動(dòng)子元件（TRE，也叫 tetO）控制的 Cre 工具鼠（TRE-Cre，也叫 tetO-Cre）。
· 另一種是由組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)四環(huán)素轉(zhuǎn)錄活化因子 rtTA 或 tTA 的小鼠。

tetO 本身缺乏啟動(dòng)子活性，無(wú)法獨(dú)立驅(qū)動(dòng)下游基因的表達(dá)。只有當(dāng)具有轉(zhuǎn)錄激活功能的 rtTA 或者 tTA 與 tetO 結(jié)合后才能激活 Cre 的表達(dá)。  rtTA 或 tTA 與 tetO 的結(jié)合受四環(huán)素或四環(huán)素衍生物強(qiáng)力霉素（Dox）的調(diào)節(jié)。tTA 在沒有 Dox 的時(shí)候與 tetO 結(jié)合誘導(dǎo) Cre 表達(dá)，有 Dox 的時(shí)候不能與 tetO 結(jié)合，Cre 不表達(dá)；rtTA 與 tTA 相反，有 Dox 的時(shí)候與 tetO 結(jié)合，誘導(dǎo) Cre 表達(dá), 沒有 Dox 的時(shí)候與 tetO 不結(jié)合，Cre 不表達(dá)。因此，在 tetO-Cre 與組織特異性 rtTA  （或 tTA ）雙轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠中，可以通過(guò)給予或撤離 Dox 來(lái)控制 Cre 重組酶在特定組織中產(chǎn)生的時(shí)間。

看起來(lái)有點(diǎn)復(fù)雜有木有？希望下面這張示意圖能幫你理解 tetO-Cre 在 CKO 中的應(yīng)用。

tetO-Cre 與 rtTA 小鼠聯(lián)用，在給予 Dox 的情況下敲除目的基因。

圖片來(lái)自《Transgenesis Techniques Principles and Protocols》Third Edition

所以，利用四環(huán)素誘導(dǎo)條件性基因敲除需要 3 種基因工程小鼠同時(shí)使用，相互交配才能最終獲得 flox 純合且 Cre 與 rtTA（或 tTA）雙陽(yáng)性的子代小鼠。整個(gè)系統(tǒng)較為復(fù)雜，繁育及基因型鑒定工作量都比較大。

2. 干擾素誘導(dǎo)型 Mx1-Cre

干擾素誘導(dǎo)是通過(guò) Mx1 基因啟動(dòng)子對(duì)于干擾素的響應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 Mx1-Cre 小鼠在一般狀態(tài)下不表達(dá) Cre 重組酶，但可以通過(guò)干擾素 -α、干擾素 -β 或人工合成的雙鏈 RNA 類似物 poly I:C 的處理而誘導(dǎo)表達(dá) Cre。

利用 Mx1-Cre 雖然可用于在發(fā)育過(guò)程中的任意時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)目的基因敲除小鼠，但僅限于在響應(yīng)干擾素的細(xì)胞中。目的基因敲除的效率也依賴于組織或細(xì)胞對(duì)干擾素的響應(yīng)水平或干擾素響應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量。

Detection of the Extent of Cre-Mediated Recombination in Different Tissues of pIpC-Treated Arnt-Floxed/Mx1-Cre Mice.

圖片來(lái)自 Mol Endocrinol. 2000 Oct;14(10):1674-81.

3. 雌激素誘導(dǎo)型 Cre-ER

將雌激素受體（estrogen receptor，簡(jiǎn)稱 ER）的配體結(jié)合區(qū)與 Cre 重組酶相融合，形成定位于胞漿中的融合蛋白（Cre-ER）。這樣就通過(guò)控制雌激素的注射時(shí)間，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因重組時(shí)間特異性的調(diào)控。

可是機(jī)體自身不是就有雌激素分泌嗎？為了避免內(nèi)源雌激素的干擾，在人 ER 的配體結(jié)合區(qū)做一個(gè)點(diǎn)突變（G521R）就可以使 Cre-ER 只響應(yīng)外源的人工合成雌激素（比如：Tamoxifen、4-OHT） 的誘導(dǎo)，命名為  Cre-ERT。之后，另一種 LBD 突變體融合蛋白被證明對(duì) 4-OHT 具有遠(yuǎn)高于 Cre-ERT 的敏感性，這種突變體就是大名鼎鼎的 Cre-ERT2 啦。它帶有人 ER LBD 中的 3 個(gè)點(diǎn)突變：C400V/M543A/L544A。

Cre-ER 系統(tǒng)，特別是 Cre-ERT2 ，是目前應(yīng)用最廣泛的誘導(dǎo)型 Cre 系統(tǒng)。其較之四環(huán)素誘導(dǎo)型 Cre，系統(tǒng)更為簡(jiǎn)單。我們只需要將 Cre-ERT2 設(shè)計(jì)在組織特異性啟動(dòng)子之后，并與 flox 小鼠交配，就可以通過(guò)在特定時(shí)間點(diǎn)給予 Tamoxifen 來(lái)最終實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的時(shí)空特異性敲除啦。

圖片來(lái)自《Transgenesis Techniques Principles and Protocols》Third Edition

文章來(lái)源南模生物，更多技術(shù)資料詳見：http://c.biomart.cn/modelorg/animal