南極磷蝦肽改善高尿酸血癥機制研究

傅安妮，張雷，閆子怡，岳昊，符萌，王靜鳳*(中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島 266003 )

摘   要：目的 探究南極磷蝦肽(AKP)對于高尿酸血癥模型小鼠的降尿酸功效及其作用機制。方法 采用高效 液相色譜(HPLC)法體外篩選出具尿酸合成關(guān)鍵限速酶—黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase, XOD)抑制活性 的 AKP，體內(nèi)動物實驗驗證 AKP 的降尿酸活性。雄性 Balb/c 小鼠采用高嘌呤飼料(25% 酵母浸粉)喂養(yǎng)聯(lián)合 腹腔注射尿酸酶抑制劑(氧嗪酸鉀，200 mg ·kg?1 ·BW?1 )建立高尿酸血癥小鼠模型，造模 21 d 后進行AKP 干 預。小鼠隨機分為正常對照組(生理鹽水)、模型對照組(生理鹽水)、陽性藥組(非布司他)、AKP 低劑量組 (450 mg·kg?1 ·BW?1 )、AKP 高劑量組(900 mg·kg?1 ·BW?1 )，干預 30 d 后檢測血清尿酸含量(Uric acid, UA)、肝 臟尿酸合成關(guān)鍵酶酶活、腎臟及腸道尿酸轉(zhuǎn)運蛋白 mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平及形態(tài)學改變。結(jié)果 AKP 體外XOD 抑 制率可達 24.4%。動物實驗驗證表明 AKP 可顯著降低高尿酸模型小鼠的 UA，作用機制為通過抑制肝臟尿酸合 成關(guān)鍵酶 XOD 及腺苷脫氨酶(Adenosine Deaminase, ADA )酶活，從而抑制肝臟尿酸生成；上調(diào)腎臟及腸道 尿酸分泌轉(zhuǎn)運體三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白(ATP binding cassette superfamily G member 2, ABCG2)、有機陰 離子轉(zhuǎn)運體(organic anion transporter 1, OAT1)轉(zhuǎn)錄水平，并抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運體葡萄糖轉(zhuǎn)運體 9(glucose transporter 9, GLUT9)、尿酸轉(zhuǎn)運體 1(urate transporter 1, URAT1)轉(zhuǎn)錄水平，從而促進腎臟及腸道尿酸排泄。AKP 可顯著降低血清尿素氮(Blood urea nitrogen, BUN )含量，腎臟及腸道切片觀察結(jié)果進一步表明，AKP 可 以顯著改善高尿酸血癥造成的腎臟及腸道損傷，維護腎臟及腸道尿酸排泄功能。結(jié)論 AKP 可通過抑制肝臟尿 酸生成，促進腎臟及腸道尿酸排泄，維護腎臟及腸道形態(tài)及功能，從而改善高尿酸血癥。

高尿酸血癥是由于體內(nèi)肝臟尿酸生成過多或 (和)腎臟及腸道尿酸排泄不足而引起 UA 含量升 高的一類代謝疾病。高尿酸血癥是痛風的發(fā)病基 礎(chǔ)，其已成為繼高血壓、高血糖、高血脂之后的 第四大健康風險因素 [1]。據(jù)《2017 年中國痛風現(xiàn) 狀報告白皮書》顯示，我國高尿酸血癥患者人數(shù) 已達 1.7 億，其中痛風患者超過 8 000 萬人，高 尿酸血癥每年正以 9.7% 的增長率迅速增加，預 計到 2020 年，高尿酸血癥患者將超過 2.0 億人， 痛風人數(shù)將達到 1 億。高尿酸血癥還與心血管疾 病 [2-3] 、II 型糖尿病 [4] 、高血壓 [5] 、慢性腎臟病 [6]   等疾病息息相關(guān)。目前用于治療高尿酸血癥的降 尿酸藥物根據(jù)不同作用靶點可以分為四大類，包 括促尿酸排泄劑、尿酸生成抑制劑、加速尿酸溶 解類藥物和兼具抑制尿酸生成與促尿酸排泄的藥 物 [7-8]。臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)這些藥物易引起胃腸道不適、 皮疹和腎毒性及肝功能異常等不良反應(yīng)。因此， 開發(fā)食源性、安全高效的降尿酸功效成分輔助治 療高尿酸血癥是未來研究的新方向。

南極磷蝦生物資源量約為 1.25 億 ~7.5 億噸， 但目前處于尚未充分開發(fā)利用的狀態(tài) [9- 10] 。南極磷 蝦蛋白質(zhì)含量豐富 [11] ，是全球最大的潛在蛋白質(zhì) 資源庫 [12] 。目前已發(fā)現(xiàn) AKP 具有多種生物活性， 如改善骨關(guān)節(jié)炎 [13] 、骨質(zhì)疏松 [14] 、糖尿病 [15] 、降 血壓 [16]  和抗氧化活性 [17]  等， AKP 是否具降尿酸功效未見相關(guān)研究，本文將探討 AKP 改善高尿酸 血癥的功效及其作用機制，為高尿酸血癥的輔助 治療提供 1 種新思路。

1    材料與方法

1.1    主要儀器與試劑

1.1.1    AKP

AKP 、金槍魚肽、沙丁魚肽由中國海洋大學 食品科學與工程學院王彥超博士贈予，AKP 相 對分子質(zhì)量主要分布在 200~2 000 ，蛋白質(zhì)含量 85.25%。

1.1.2    實驗動物

雄性無特定病原體級( SPF 級) Balb/c 小 鼠，體質(zhì)量( 22.0 ± 2.0 ) g ，來源于北京維通利華 實驗動物技術(shù)公司，動物合格證號 ：SCXK (京) 2014-0001。飼養(yǎng)室進行 12 h 光照 12 h 黑暗交替， 保持良好通風，控制飼養(yǎng)溫度為( 23 ± 1 ) ℃， 飼 養(yǎng)期間小鼠自由進食和飲水。

1.1.3    主要試劑

黃嘌呤氧化酶( XOD )、黃嘌呤、別嘌呤醇 (美國 Sigma 公司)；尿酸( UA ) Elisa 試劑盒(北 京中生北控生物科技股份有限公司)；BUN 、XOD 及腺苷脫氨酶( ADA )試劑盒(南京建成生物工 程研究所)；Trizol 試劑、引物、dNTP Mixture、 M-MLmLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、RiboLock RNA 酶抑制劑[ 生工生物工程(上海)股份有限公司] ；SYBR Green 熒光染料(中國 Novoprotein 公司)；其他生 化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2    儀器與設(shè)備

1100 型號高效液相色譜儀 , 紫外檢測器(美 國 Aglient 公司)；Model 680 型酶標儀(美國 Bio- RAD 公司)；BH14 光學顯微鏡(日本 OLYMPUS 公司)；NanoDrop-2000 微量分光光度計(杭州 奧神儀器有限公司)；LightCycler480 型 Real-time PCR 儀(德國 Roche 公司)；KZ-II 高速組織研磨 儀(武漢塞維爾生物科技有限公司)。

1.3    實驗方法

1.3.1    體外 XOD 抑制率測定方法

參考文獻 [18] 確定 XOD 抑制率測定方法 ：150 μL 黃嘌呤( 0.7 mmol/L) 中加入 50 μL 受試物 ( 40 mg/mL)或空白對照后，再加入 50 μL XOD ( 0.15 IU/mL)， 37  ℃孵育 25 min，加 80 μL HCl ( 1 mol/L)終止反應(yīng)。黃嘌呤溶液、受試物及 XOD 均用 100 mmol/L Hepes (pH 7.4 )緩沖溶液 溶解，整個反應(yīng)體系均在緩沖溶液中進行。將反 應(yīng)混合物用超純水稀釋 10 倍后，用 0.22 μm 尼龍 膜進行高效液相色譜分析。每種測試樣品進行 3 次重復分析。別嘌呤醇用作陽性對照。

高效液相色譜條件 ：XDB C18  柱( 250 mm × 4.6 mm ，5 μm )，柱溫 30 ℃，流速 1 mL/min，波 長 290 nm (紫外檢測器)，進樣時間 15 min，進 樣量 20 μL，洗脫條件見表 1。

1.3.2    動物模型建立

本研究采用高嘌呤飼料( 25% 酵母浸粉)喂 養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射尿酸酶抑制劑(氧嗪酸鉀)建立 高尿酸血癥小鼠模型。選取 Balb/c 小鼠 25 只， 隨 機 分 為 正 常 組( n=5 )、 模 型 組( n=20 )。正常組喂養(yǎng)正常飼料，注射生理鹽水 21 d ；模型 組喂養(yǎng) 25% 酵母浸粉，同時腹腔注射氧嗪酸鉀 ( 200 mg ·kg?1 ·BW?1 ，  隔 天 注 射 )， 造 模 21 d 后 成 功建立 高尿 酸血癥模 型。然后進行受試物 干預 ：正常對照組( 0.85% 生理鹽水)，造模 成功老鼠隨機分為模型對照組( 0.85% 生理鹽 水)、陽性藥組( 7.5 mg ·kg?1 ·BW?1  非布司他)、 AKP- 低劑量組( 450 mg ·kg?1 ·BW?1 )，AKP- 高劑 量組( 900 mg ·kg?1 ·BW?1 )，每組 5 只，灌胃體積 10 mg ·kg?1 ·BW?1 ，每日灌胃 1 次，連續(xù)灌胃 30 d， 期間正常對照組飼喂標準飼料，其余組飼喂含有 25% 酵母浸粉飼料。

末次給藥后小鼠禁食不禁水 8 h。稱量體質(zhì)量， 摘眼球取血，分離血清備用。迅速剝離肝臟、腎 臟及腸道，稱重。每組各取0.1 g 置于液氮保存?zhèn)溆?。另各?0.5 cm3  肝臟、腎臟及腸道于 10% 中性甲 醛中固定備用。

1.3.3    血清中尿酸和 BUN 的測定

UA 和 BUN 的含量嚴格按照試劑盒說明測定。1.3.4    肝組織 XOD 及 ADA 活力測定肝臟勻漿制備 ：取出凍存的肝臟 0.1 g ，按質(zhì) 量體積比 1 ∶9 加入 9 mL 生理鹽水，加研磨珠研 磨，高速組織研磨儀( 60 Hz ，60 s )震蕩 3 次得 肝臟勻漿液，并按 BCA 蛋白濃度試劑盒測定蛋白 濃度。

XOD 及 ADA 酶活按照試劑盒說明進行檢測。 

1.3.5    腎臟及回腸組織形態(tài)學分析

大鼠處死后，切取腎臟扇形切塊及 1 cm 左右 回腸，立即置入 10% 的中性甲醛中固定 24 h，乙 醇梯度脫水后進行石蠟包埋與 HE 染色，于光學 顯微鏡下觀察組織學特點。

1.3.6    RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄

總 RNA 的提取 ：采用 RNA 試劑盒法提取 肝臟 RNA，NanoDrop-2000 微量分光光度計測定 RNA 純度和濃度。

逆 轉(zhuǎn) 錄 ：體 系 ：1 μg RNA 樣 品、 1.5 μL 隨機引物、用無核酸酶水( DEPC )水補足至 12.5 μL ，70 ℃預變性 5 min。待冷卻至 4 ℃加入 1 μL M-MLV 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶、5 μL M-MLv 5x buffer、 2 μL dNTPs 、0.5 μL RNA 酶抑制劑、DEPC 水補 足到 25 μL。逆轉(zhuǎn)錄條件為：30 ℃、 10 min，37 ℃、 60 min ，90 ℃、 5 min。

1.3.7    qRT-PCR 分析

采用 qRT-PCR 分析法測定肝臟中 β-actin、ABCG2 、OAT1 、GLUT9 、URAT1 、OCT2mRNA水平，各基因相對表達量以目的基因 mRNA 表達 量 /β-actin 表示。反應(yīng)體系為 25 μL ：cDNA 樣品5 μL、對應(yīng)基因的上下游引物各 0.75 μL 、DEPC 水 6 μL 、SYBR 熒光染料 12.5 μL。擴增條件為 ：95 ℃預變性 10 min，95 ℃變性 15 s，60 ℃退火20 s， 72  ℃延伸 30 s ，35 個循環(huán)。各基因引物序列 見表 2。

1.3.8    統(tǒng)計學分析

實驗結(jié)果以均值 ± 標準差( ± s )表示，使 用 SPSS 22.0 軟件進行單因素方差統(tǒng)計學分析 ( ANOVA )，以 P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2    實驗結(jié)果

2.1    體外 HPLC 法測定 AKP 的 XOD 抑制率結(jié)果

XOD 是尿酸合成途徑中的關(guān)鍵限速酶，如 表 3 ，體外 XOD 抑制率 HPLC 測定結(jié)果表明，以 別嘌呤醇為陽性對照，在 AKP、金槍魚肽及沙丁 魚肽中，AKP 體外 XOD 抑制率最高，為 24.44%， 具有潛在的降尿酸活性。

2.2    AKP 對 UA 影響結(jié)果

如圖 1 所示，相比正常組，模型組 UA 顯著 升高( P<0.01 )，表明高尿酸血癥模型建立成功。相比模型組，AKP 低、高劑量組均可顯著降低 UA 水平( P<0.01 )，分別降低 17.45% 、25. 16%， 表明 AKP 具有顯著改善高尿酸血癥的功效。

2.3    AKP 對 XOD 及 ADA 的影響結(jié)果

XOD 及 ADA 是肝臟尿酸生成的關(guān)鍵酶。如 圖 2 ，相比正常組，模型組肝臟 XOD 及 ADA 酶 活均顯著升高( P<0.01 )。相比模型組，AKP 低、 高劑量組均可顯著抑制肝臟尿酸合成酶 XOD 及 ADA 活性( P<0.01 )，可降低 XOD 酶活 25.33%、 33.70% 及 ADA 酶活 36.03% 、29. 16%，表明 AKP  可通過抑制肝臟尿酸生成來降低 UA 水平，從而 改善高尿酸血癥。

2.4    AKP 對腎臟尿酸排泄的影響結(jié)果

2.4.1    AKP 對腎臟尿酸分泌轉(zhuǎn)運體 mRNA 轉(zhuǎn)錄水 平的影響結(jié)果腎臟是尿酸排泄的主要器官，約有 2/3 的尿酸由腎臟排泄。腎臟尿酸轉(zhuǎn)運體 ABCG2 及 OAT1 介導腎臟尿酸排泄。如圖 3 ，相比正常組，模型 組腎臟尿酸分泌轉(zhuǎn)運體 ABCG2 及 OAT1 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著降低( P<0.01 )，表明高尿酸血癥腎 臟尿酸排泄功能受損。相比模型組，AKP 低劑量組可顯著升高 ABCG2 及 OAT1 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平 ( P<0.01 )，分別升高 28.66% 、39.24%，AKP 高劑 量組可顯著升高 OAT1 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平( P<0.01 )， 可升高 39.34% ，表明 AKP 可促進腎臟對尿酸的 排泄。

2.4.2    AKP 對腎臟尿酸重吸收轉(zhuǎn)運體 mRNA 轉(zhuǎn)錄 水平的影響結(jié)果

腎臟尿酸轉(zhuǎn)運體 GLUT9 及 URAT1 介導腎臟 尿酸重吸收。如圖 4 ，相比正常組，模型組腎臟 尿酸重吸收轉(zhuǎn)運體 GLUT9 及 URAT1 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著上升( P<0.01 )。相比模型組，AKP 低、 高劑量組可顯著降低 GLUT9 及 URAT1 mRNA 轉(zhuǎn) 錄水平( P<0.01 )，分別降低 35.27% 、38.85% 和 44.61% 、42.99% ，表明 AKP 可以抑制腎臟對尿酸 的重吸收。

2.4.3    AKP 對腎臟陽離子轉(zhuǎn)運體 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平 的影響結(jié)果

腎臟尿酸轉(zhuǎn)運體 OCT2 介導腎臟陽離子的轉(zhuǎn) 運。如圖 5 ，相比正常組，模型組腎臟尿酸陽離子 轉(zhuǎn)運體 OCT2 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著降低( P<0.01 )。相比模型組，AKP 低、高劑量組均可顯著升高 OCT2 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平( P<0.01 )，分別可升高 65.81% 、57.31%，表明 AKP 可促進腎臟對陽離子 的轉(zhuǎn)運，減少有毒物質(zhì)在腎臟的積累，增強小鼠 腎功能。

2.5    AKP 對腸道 ABCG2 及 GLUT9 mRNA 轉(zhuǎn)錄 水平的影響結(jié)果

尿酸 1/3 由小腸排泄，若在腎功能受損時， 尿酸的腸道排泄是維持機體血尿酸水平趨于穩(wěn)定 的主要途徑。腸道尿酸轉(zhuǎn)運體 ABCG2 及 GLUT9 分別介導尿酸的排泄及重吸收。如圖 6 ，相比正 常組，模型組腸道尿酸排泄轉(zhuǎn)運體 ABCG2 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著降低( P<0.01 ) , 腸道尿酸重吸收轉(zhuǎn)運體 GLUT9 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著上升( P<0.01 )。相比模型組，AKP 低劑量組可顯著提高 ABCG2 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平( P<0.01 )，可提高 55.09%，AKP 低、高劑量組均可顯著降低 GLUT9 mRNA 轉(zhuǎn)錄水 平( P<0.01 )，分別可 降低 31.20% 、38.78%。表 明 AKP 可以促進腸道尿酸排泄，抑制腸道尿酸重 吸收。

2.6 AKP 對腎臟組織的影響結(jié)果

BUN 是反映腎功能的指標。如圖 7A ，相比 正常組，模型組 BUN 水平顯著上升( P<0.01 )。相比模型組，AKP 組低、高劑量組均可顯著降低 BUN 水平( P<0.01 )，分別降低 25.08% 、26.45%。腎臟 H&E 切片及 MASSON 染色如圖 7B 、C ，相 比正常組，模型組主要表現(xiàn)為腎小管間質(zhì)損傷， 腎小管擴張，腎小管上皮細胞萎縮，腎小球細胞 核數(shù)明顯增多，腎間質(zhì)和腎小管上皮細胞頂端出 現(xiàn)局部纖維化。相比模型組，AKP 可顯著改善腎 間質(zhì)損傷、腎小管擴張及腎臟的局部纖維化，改 善高尿酸血癥造成的腎臟損傷。此外，觀察到陽性藥(非布司他)可加重模型小鼠的腎臟纖 維化，這可能是其降低 UA 同時導致的毒副作用 之一。

2.7 AKP 對腸道組織影響結(jié)果

如圖 8 ，正常組小腸絨毛呈細長指狀，絨毛 排列緊密，黏膜上皮層清晰完整，柱狀上皮細胞 呈線裝規(guī)則排列。相比正常組，模型組小腸絨毛 明顯腫脹變短，絨毛數(shù)量變少，分布稀疏，小腸 絨毛長度及隱窩深度比減小，腸道吸收功能破壞， 黏膜上皮層邊緣模糊破損呈彌散狀，柱狀上皮細 胞堆積且排列混亂。相比模型組，AKP 組可顯著 改善高尿酸血癥造成的腸道損傷。

3 討論

目前，已有研究表明多種海洋活性肽具有良 好的降尿酸活性，例如羅非魚皮膠原蛋白肽、海 洋魚抗痛風肽、鰹魚肽、金槍魚肽、鯊魚軟骨水 解肽和海參寡肽等，研究表明活性肽改善高尿酸 血癥的作用機理可分為兩方面 ：一方面抑制尿酸 生成，通過抑制機體尿酸生成過程中的關(guān)鍵酶的 活性，例如 XOD 、ADA、磷酸核糖焦磷酸合成酶 ( PRPS )和嘌呤核苷磷酸化酶( PNP )等。另一方 面通過促進腎臟及腸道尿酸排泄，主要通過促進 尿酸分泌轉(zhuǎn)運體將尿酸排出體外，抑制尿酸重吸 收轉(zhuǎn)運體將尿酸重吸收回血液。

在本研究中，AKP 可顯著降低肝臟 XOD 及 ADA 酶活，抑制尿酸生成 ；鄒琳及李宇娟 [19-20]  發(fā) 現(xiàn)鰹魚降尿酸肽的疏水性氨基酸殘基與 XO 分子 活性區(qū)域關(guān)鍵疏水性氨基酸具有良好親和力，與 XOD 催化底物黃嘌呤之間存在競爭同一結(jié)合位點 的現(xiàn)象，具較強的 XOD 抑制活性 ；何偉煒 [21]  發(fā) 現(xiàn)金槍魚肽可與底物競爭 XO 活性中心位點，并 與 XO 活性中心 Phe-914 、Ser-876 及 Thr- 1010 殘 基之間存在相互作用，從而起到抑制XO 活性作用；劉洋 [22]  發(fā)現(xiàn)海洋魚抗痛風肽通過降低大鼠肝臟細 胞中 ADA 和 XOD 2 種酶的 mRNA 表達量及抑 制 XOD 活性來實現(xiàn)降低尿酸水平的目的 ；Murota等 [23]  發(fā)現(xiàn)鯊魚軟骨水解肽也可抑制 XOD 酶活， 均與本實驗結(jié)果類似。

盛周煌 [24]  發(fā)現(xiàn)羅非魚皮膠原蛋白肽 TP 能下 調(diào)腎臟尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運體 URAT1 蛋白的表達 量，降低尿酸重吸收 ；Wan 等 [25]  發(fā)現(xiàn) 2 種海參 寡肽可抑制腎臟尿酸鹽重吸收轉(zhuǎn)運蛋白( OAT4、 GLUT9 和 URAT1 ) 的表達，抑制尿酸重 吸 收， 促進腎臟尿酸鹽分泌轉(zhuǎn)運蛋白( ABCG2 、MRP4  和 OAT1 )的表達，促進尿酸排泄。本研究表明， AKP 可上調(diào)腎臟及腸道尿酸分泌轉(zhuǎn)運體表達，抑 制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運體表達，促進尿酸排泄，符合 上述研究結(jié)果。

高尿酸血癥會引起腎臟及腸道損傷 [26-27] ，海 洋活性肽在有效降低 UA 的同時還可保護腎臟及 腸道功能。Li 等 [28]  發(fā)現(xiàn)氧嗪酸鉀( PO )誘導的 高尿酸血癥大鼠腎組織顯示管狀上皮細胞脫落、 管狀擴張和間質(zhì)細胞浸潤，鰹魚水解肽( BH )可 改善高尿酸血癥大鼠的腎臟組織病理學改變、腎 小球和腎小管結(jié)構(gòu)相對規(guī)則，無腫脹和變性。Han 等 [29]  發(fā)現(xiàn)金槍魚寡肽( TMOP )治療增加了腎臟 指數(shù)，降低了血清肌酐濃度( P<0.05 )和 BUN 濃度， 2 種 TMOP 治療結(jié)腸中的 occludin 和 claudin- 1 水 平相比模型組均顯著上升，保護了腸道的完整性。本研究也同樣發(fā)現(xiàn)了 AKP 可以改善高尿酸血癥導 致的腎臟和腸道損傷。

在本研究中，通過體外篩選及體內(nèi)動物實驗 驗證表明 AKP 具有良好的改善高尿酸血癥功效， 抑制機制為降低肝臟 XOD 及 ADA 酶活，抑制尿 酸生成 ；上調(diào)腎臟及腸道尿酸分泌轉(zhuǎn)運體表達， 抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運體表達，促進尿酸排泄。通 過測定 BUN 含量以及腎臟及腸道 H&E 切片觀察 結(jié)果表明，AKP 可以改善高尿酸血癥造成的腎臟 及腸道損傷，維護腎臟及腸道尿酸排泄功能。

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