我們通過UPLC ESI Orbitrap MS在正離子模式和負(fù)離子模式下分析LF中化學(xué)成分的特征（圖1）。表2中列出了具有堿性類黃酮結(jié)構(gòu)的主要成分。

表1 RT-PCR的引物序列

表2 LF的化學(xué)成分

圖1 LF中化學(xué)成分的識別

如圖2B和C所示，與正常（NC）組相比，給予乙醇導(dǎo)致胃損傷，表現(xiàn)為多發(fā)性線性出血、局灶性糜爛和潰瘍指數(shù)顯著升高（p＜0.0001）。然而，與GU組相比，我們在LF（150 mg/kg和300 mg/kg）或奧美拉唑（OME）給藥中觀察到黏膜出血條紋的長度和數(shù)量顯著減少，表明LF對潰瘍的改善。此外，LFH具有與陽性對照藥物相當(dāng)?shù)奈副Ｗo(hù)潛力。

圖2 LF對乙醇誘導(dǎo)大鼠胃潰瘍的保護(hù)作用。（A）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。（B）宏觀代表性圖像。（C）不同組中的UI指數(shù)（n?=?8）。（D）胃組織的H&E染色（橙色箭頭：胃上皮細(xì)胞丟失；藍(lán)色箭頭：局灶性壞死；綠色箭頭：出血性損傷；紅色箭頭：黏膜下水腫；黑色箭頭：炎癥細(xì)胞浸潤）。（E-H）胃組織中MDA、GSH、SOD和CAT的水平（n?=?5）。（I-M）胃組織中TNF-α、IL-6、IL-1β、NF-κb和Iκbα的mRNA表達(dá)（n?=?5）。（N-O）血清和胃組織中NO的水平（N?=?5）。#p<?0.05，##p?<?0.01，###p?<?0.001，以及####p?<?0.0001與NC組相比；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和***p?<?0.0001與GU組相比；與LF 150 mg/kg組和OME組相比，@p＜0.05、@p＜0.01。

H&E染色證實(shí)了LF減輕乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷的能力，而NC組顯示出完整的胃黏膜結(jié)構(gòu)和整齊排列的胃腺（圖2D）。如箭頭所示，乙醇誘導(dǎo)了一系列明顯的損傷，其特征是局灶性壞死、黏膜出血性損傷、黏膜下水腫、炎癥細(xì)胞浸潤以及上皮細(xì)胞損失。然而，與GU組相比，OME、LF（150 mg/kg）和LF（300 mg/kg）組的黏膜損傷顯著減輕?？傊芯拷Y(jié)果表明LF改善了GU大鼠的組織病理學(xué)表現(xiàn)。

接下來，我們評估了LF對抗氧化應(yīng)激和抗炎癥的影響。如圖2E-H所示，與NC大鼠相比，乙醇誘導(dǎo)的大鼠MDA含量顯著升高，而GSH、SOD和CAT活性顯著下降。然而，OME和LF（150 mg/kg、300 mg/kg）處理將上述抗氧化因子逆轉(zhuǎn)至正常水平。此外，OME、LFL和LFH均顯著逆轉(zhuǎn)了乙醇引起的NF-κb、TNF-α、IL-1β和IL-6水平的升高以及Iκbα水平的降低（圖2I-M）。

如圖2N-M所示，與NC大鼠相反，GU大鼠血清和胃組織中的NO濃度顯著降低（p?<?0.001)。同時(shí)，LF（150 mg/kg、300 mg/kg）能夠以劑量依賴的方式顯著恢復(fù)NO濃度。

在這一部分中，我們基于液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）對NC、GU和LFH組的血清分析了非靶向代謝組學(xué)圖譜。QC樣品在正離子和負(fù)離子檢測模式下的總離子色譜（基峰）如圖3A和B所示，表明儀器是穩(wěn)定的。經(jīng)過峰校正和組內(nèi)去除缺失值?> 50%的離子峰，我們分別以正離子和負(fù)離子模式去除了499和377種代謝物。PLS-DA在NC組、GU組和LFH組之間有明顯的代謝物聚集（圖3C和D）。我們發(fā)現(xiàn)GU組與NC組的距離最遠(yuǎn)，然而，LFH組有接近NC組的趨勢，表明乙醇引發(fā)了代謝產(chǎn)物的變化，LF（300mg/kg）處理在內(nèi)源性物質(zhì)含量遷移到正常水平方面發(fā)揮了作用。

NC組與GU組和GU與LFH組的OPLS-DA評分圖顯示出明顯的分離（圖4）。此外，我們還進(jìn)行了200置換檢驗(yàn)，以驗(yàn)證OPLS-DA模型的可靠性。結(jié)果表明，Q2回歸線的截距小于0，表明根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立的OPLS-DA模型沒有過擬合，該模型在篩選差異代謝物方面具有較高的可靠性。

根據(jù)OPLS-DA獲得的VIP>1.0和p值＜0.05，共有165種代謝產(chǎn)物被定義為差異代謝產(chǎn)物。與NC組相比，GU組分別有49種和22種代謝產(chǎn)物被顯著誘導(dǎo)和抑制。然而，LF部分逆轉(zhuǎn)了乙醇誘導(dǎo)胃損傷的代謝變化，消除了GU大鼠的25種代謝變化，其中16種下調(diào)，9種上調(diào)。因此，這25種代謝產(chǎn)物被定義為LF保護(hù)作用的關(guān)鍵生物標(biāo)志物。表S1中總結(jié)了這些生物標(biāo)志物不同組中相應(yīng)的化合物名稱、質(zhì)荷比（m/z）、分子式、保留時(shí)間和變化趨勢。與LF處理相比，乙醇誘導(dǎo)改變的差異代謝產(chǎn)物通過熱圖可視化（圖5A）。

為了進(jìn)一步研究LF改善胃潰瘍的可能機(jī)制，我們在MetaboAnalyst5.0中引入了不同的代謝產(chǎn)物(https://www./)用于途徑富集。如表3和圖5B所示，共富集了11條代謝途徑。在途徑影響>0.1的條件下，五種代謝途徑被認(rèn)為是關(guān)鍵的代謝途徑，包括氨基酸代謝、碳水化合物代謝以及輔因子和維生素的代謝。代謝物網(wǎng)絡(luò)和相關(guān)途徑如圖5C所示。

7. 結(jié)合代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

如圖6A所示，我們在LF靶點(diǎn)和潛在代謝物相關(guān)靶點(diǎn)之間鑒定出176個(gè)重疊靶點(diǎn)。使用Cytoscape（版本3.10.0）軟件，建立了一個(gè)“成分-靶點(diǎn)-代謝物”網(wǎng)絡(luò)，以說明LF和差異代謝物之間的復(fù)雜關(guān)系（圖6B）。根據(jù)節(jié)點(diǎn)degree，我們篩選出顯著的活性成分。LF中更重要的成分是甘草素、甘草黃酮A、甘草查爾酮A、甘草查爾酮B和Echinatin，在degree上排名前五。這表明這些活性成分對正常代謝產(chǎn)物和胃保護(hù)至關(guān)重要。

為了進(jìn)一步探討LF抗胃潰瘍的潛在機(jī)制，我們建立了由176個(gè)節(jié)點(diǎn)和414條邊組成的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖6C）。如圖所示，熱休克蛋白90α家族A類成員1（HSP90AA1）（D?=?33）、蘇氨酸激酶1（AKT1）（D?=?32）、有絲分裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）（D?=?29）、表皮生長因子受體（EGFR）（D?=?26）、雌激素受體1（ESR1）（D?=?21）和磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亞基α（PIK3CA）（D?=?18）在PPI網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)核心地位，被認(rèn)為是LF治療胃潰瘍的核心靶點(diǎn)。此外，生物過程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞成分（CC）中按p值排序的前十個(gè)富集GO項(xiàng)如圖6D所示，提示LF可能影響炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡過程的負(fù)調(diào)控、質(zhì)膜、胞質(zhì)溶膠、鋅離子結(jié)合和酶結(jié)合?；贙EGG富集分析（圖6E），LF可能在調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號通路、Rap1信號通路、HIF-1信號通路和MAPK信號通路中發(fā)揮重要作用。

此外，我們還采用分子對接方法分析了LF的五種核心成分與六種核心靶點(diǎn)（HSP90AA1、AKT1、MAPK1、EGFR、ESR1、PIK3CA）之間的相互作用。更穩(wěn)定的配體-受體配置需要更低的結(jié)合能，這反映在對接得分中。如前所述，小于-5.0 kcal/mol的對接得分表明配體和受體之間具有良好的結(jié)合活性。如表S2所示，所有核心靶點(diǎn)，特別是AKT1和PIK3CA，對LF中的治療成分具有良好的結(jié)合親和力（對接得分＜?5.0 kcal/mol）。每個(gè)靶點(diǎn)的最佳對接結(jié)果進(jìn)一步顯示為3D和2D結(jié)合圖（圖7）。核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)形成穩(wěn)定的復(fù)合物，例如，甘草黃酮A與與AKT1結(jié)合的氨基酸殘基GLN79和ASN54形成兩個(gè)氫鍵。甘草黃酮A-PIK3CA復(fù)合物通過一個(gè)氫鍵穩(wěn)定在氨基酸殘基上。

圖7 三維和二維對接模型的關(guān)鍵靶點(diǎn)的最優(yōu)對接結(jié)果。（A）甘草查爾酮A-HSP90AA1；（B）甘草黃酮A-AKT1；（C）甘草黃酮A-MAPK1；（D）甘草黃酮A-EGFR；（E）甘草查爾酮B-ESR1；（F）甘草黃酮 A-PIK3CA。

我們使用RT-qPCR檢測上述關(guān)鍵靶點(diǎn)，以探討它們是否參與LF在GU中介導(dǎo)的作用。如圖8所示，GU組HSP90AA1、AKT1、MAPK1、EGFR、ESR1和PIK3CA的表達(dá)均受到顯著抑制，而在LF給藥中觀察到上述基因的顯著增加，提示LF可以調(diào)節(jié)這些核心基因的表達(dá)。

圖8 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)關(guān)鍵靶點(diǎn)驗(yàn)證結(jié)果n?=?5。（A）HSP90AA1、（B）AKT1、（C）MAPK1、（D）EGFR、（E）ESR1、（F）PIK3CA的mRNA表達(dá)。#p<?0.05，##p?<?0.01，###p?<?0.001與NC組相比；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p?<?0.0001與GU組相比；和@p?<?0.05，與LF 150mg/kg組和OME組相比。

新出現(xiàn)的證據(jù)表明，攝入乙醇可能會抑制PI3K-AKT信號通路，然而，PI3K-AKT的激活與促進(jìn)葡萄糖代謝、參與細(xì)胞增殖和黏膜修復(fù)有關(guān)。如圖9A-E所示，與NC組相比，GU組的p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT水平明顯受到抑制（p?<?0.05)，而與GU組相比，LF給藥有效地增強(qiáng)了這些蛋白質(zhì)的表達(dá)（p?<?0.05)。為了驗(yàn)證PI3K/AKT通路是否參與LF抑制細(xì)胞凋亡，我們檢測了下游凋亡相關(guān)蛋白。我們發(fā)現(xiàn)，兩種劑量的LF給藥都可以逆轉(zhuǎn)Bax和胱天蛋白酶-3的增加，以及乙醇灌胃誘導(dǎo)的Bcl-2下調(diào)（圖9F-H）。

圖9 LF可誘導(dǎo)PI3K/AKT通路的激活并減弱細(xì)胞凋亡（n?=?3）。（A-H）通過蛋白質(zhì)印跡測定p-PI3K、PI3K，p-AKT、AKT、Bax、Bcl-2和Caspase-3的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。β-肌動蛋白作為內(nèi)部對照。（I）TUNEL染色結(jié)果。#p<?0.05，##p?<?0.01，###p?<?0.001與NC組相比；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和***p?<?0.0001與GU組相比；@p?<0.05?與LF 150mg/kg組相比。

然后，我們通過TUNEL染色觀察胃黏膜細(xì)胞的凋亡變化。凋亡細(xì)胞在GU組中增加，而在LF處理組中減少（圖9I）。研究結(jié)果有力地表明，LF可以通過激活PI3K/AKT通路抑制細(xì)胞凋亡來減輕GU。

GU是一種多因素的胃腸道疾病，乙醇是引起胃潰瘍的主要誘因之一。奧美拉唑等常用藥物的臨床治療需求因其不良反應(yīng)而受到限制。甘草是中醫(yī)系統(tǒng)中最突出的材料之一，傳統(tǒng)上用于多種調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)的制劑，甘草黃酮類化合物主要用于治療胃和十二指腸潰瘍。此外，甘草作為最常用的“藥食同源”草藥之一，可以為GU治療提供高效低毒的療效。鑒于目前尚不清楚LF的作用機(jī)制以及LF抗?jié)兪欠衽c調(diào)節(jié)代謝有關(guān)，因此我們采用基于UPLC-Q-TOF/MS的代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合的方法來研究LF治療GU的潛在基因和潛在機(jī)制。根據(jù)血清代謝組學(xué)分析，LF可以部分逆轉(zhuǎn)乙醇誘導(dǎo)的胃損傷中涉及的代謝途徑，尤其是參與葡萄糖利用的氨基酸代謝。此外，代謝組學(xué)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)表明，PI3K-AKT信號通路是LF改善GU的潛在途徑之一。更重要的是，LF通過激活PI3K/AKT通路來減弱胃細(xì)胞凋亡，這與預(yù)測的結(jié)果一致。

由于乙醇誘導(dǎo)的GU發(fā)病機(jī)制與人類非常相似，因此我們在研究中使用該模型來評估LF的胃保護(hù)作用。在給予高濃度乙醇后，GU組的黏膜受到顯著損傷，出現(xiàn)多條不規(guī)則出血帶，潰瘍指數(shù)顯著升高。從宏觀和微觀觀察來看，LF能促進(jìn)胃修復(fù)，減少病理損傷，說明LF對胃潰瘍有一定的治療作用。先前的研究已經(jīng)證實(shí)，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是酒精誘導(dǎo)的胃黏膜損傷的必然特征。氧化應(yīng)激的代謝產(chǎn)物MDA表明自由基激活的脂質(zhì)過氧化介導(dǎo)細(xì)胞損傷。此外，GSH、SOD和CAT被認(rèn)為是保護(hù)性介質(zhì)，可以清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。更重要的是，過度的氧化應(yīng)激會誘導(dǎo)IκBα的泛素化和降解，以及隨后的NF-κB活化，使其自由易位進(jìn)入細(xì)胞核；接下來，它促進(jìn)以促炎細(xì)胞因子水平為代表的侵襲性因子的產(chǎn)生，如TNF-a、IL-6和IL-1β。先前的研究表明，LF在各種疾病中具有抗氧化和抗炎能力，我們的研究結(jié)果還表明，LF逆轉(zhuǎn)了乙醇攝入后胃中MDA含量增加、GSH含量降低、SOD和CAT活性降低的現(xiàn)象。此外，LF下調(diào)NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6的mRNA水平，上調(diào)IκBα，從而對GU發(fā)揮抗炎作用。

NO作為一種內(nèi)源性血管舒張物質(zhì)，通過血管舒張和促進(jìn)血液流動，在維持黏膜完整性和黏膜防御方面發(fā)揮著直接作用。此外，已經(jīng)證明NO對大鼠胃腸黏膜細(xì)胞具有抗凋亡作用。與之前的研究一致，我們的研究結(jié)果表明，LF顯著改善并將NO水平保持在正常范圍內(nèi)，表明其對黏膜完整性有有益影響。

隨后，我們研究了LF在GU治療中的代謝組學(xué)。最終，我們初步鑒定出25種不同的代謝產(chǎn)物，包括酪氨酸、煙酰胺、亞精胺、絲氨酸、3-羥基鄰氨基苯甲酸酯，它們參與11種代謝途徑。其中，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成（影響?=?0.5）、抗壞血酸和aldarate代謝（影響?=?0.25），煙酸和煙酰胺代謝（影響?=?0.194），酪氨酸代謝（影響?=?0.139），以及戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化（影響?=?0.125）是非常重要的。

先前的研究強(qiáng)調(diào)了氨基酸代謝紊亂對異常生理功能的影響及其在GU發(fā)展中的作用。苯丙氨酸羥化酶催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為L-酪氨酸，L-酪氨酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為多巴胺。多巴胺是胃的保護(hù)因子，對胃腸運(yùn)動、胃黏膜血流量和胃酸分泌具有調(diào)節(jié)作用。大量證據(jù)支持通過調(diào)節(jié)多巴胺可以改善胃潰瘍。L-色氨酸是蛋白質(zhì)合成的必需氨基酸，參與炎癥、氧化應(yīng)激和免疫的調(diào)節(jié)，其代謝紊亂可能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，進(jìn)而影響胃腸系統(tǒng)的功能。此外，色氨酸通過犬尿氨酸途徑的代謝過程導(dǎo)致煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）的從頭合成，影響煙酰胺代謝途徑。3-羥基鄰氨基苯甲酸是色氨酸的下游代謝產(chǎn)物，是L-色氨酸轉(zhuǎn)化為煙酰胺的限制因素。在本研究中，GU組的酪氨酸、色氨酸和3-羥基鄰氨基苯甲酸水平發(fā)生了顯著變化，而LF使代謝產(chǎn)物正?；砻鱈F可能通過恢復(fù)氨基酸代謝破壞在胃黏膜中發(fā)揮保護(hù)作用。

煙酰胺參與體內(nèi)糖酵解、脂肪酸合成、三羧酸循環(huán)和組織呼吸的氧化過程。研究表明，煙酰胺具有胃保護(hù)作用，可能通過增強(qiáng)胃微血管通透性及其抗氧化特性發(fā)揮作用。NAD⁺由煙酰胺合成，是一種關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)氧化還原輔因子，也是多種代謝酶的底物。NAD⁺的失調(diào)與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。目前的研究表明，與NC組相比，GU組的煙酰胺異常減少，表明該生物體的氧化還原能力在GU大鼠中受到抑制。然而，LF恢復(fù)了煙酰胺的水平，提高抗氧化能力，從而修復(fù)胃黏膜。

結(jié)合代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)策略，我們進(jìn)一步探討了LF治療GU的機(jī)制。通過構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-代謝產(chǎn)物”網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)了6個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)（HSP90AA1、AKT1、MAPK1、EGFR、ESR1、PIK3CA），它們都與GU的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。此外，KEGG分析表明，PI3K/AKT信號通路可能在LF減輕胃潰瘍中發(fā)揮重要作用。

一方面，葡萄糖代謝是維持能量來源的重要途徑，尤其是在胃潰瘍修復(fù)過程中，它高度依賴于葡萄糖的利用?；罨腁KT增強(qiáng)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，PI3K/AKT信號激活誘導(dǎo)葡萄糖激酶表達(dá)增加并促進(jìn)葡萄糖代謝。LF調(diào)節(jié)的煙酸和煙酰胺代謝以及苯丙氨酸代謝也參與糖酵解途徑，促進(jìn)能量代謝，提示LF可以通過PI3K/AKT途徑調(diào)節(jié)代謝，促進(jìn)胃黏膜修復(fù)。

另一方面，研究證明這些關(guān)鍵靶點(diǎn)與PI3K/AKT信號通路以及胃腸道疾病有關(guān)。眾所周知，EGFR對促進(jìn)傷口愈合、促進(jìn)黏膜和腺體再生至關(guān)重要，其激活可抑制胃黏膜細(xì)胞的凋亡，從而顯著加速GU的修復(fù)。MAPK1是由PI3K誘導(dǎo)的EGFR的下游，與上皮增殖和黏膜修復(fù)增強(qiáng)有關(guān)?；谖覀冎暗难芯?，已經(jīng)證實(shí)LF可以通過激活EGFR/ERK途徑促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖和胃黏膜的修復(fù)來減輕GU。ESR1編碼雌激素受體ERα和配體激活的轉(zhuǎn)錄因子。類黃酮與雌激素結(jié)構(gòu)相似，被稱為植物雌激素，通過雌激素受體ERα和ERβ發(fā)揮抗氧化機(jī)制和抗炎作用，緩解胃潰瘍。此外，當(dāng)ERα與雌激素結(jié)合時(shí)，它會導(dǎo)致MAPK1/2、PI3K和AKT的激活。PIK3CA和AKT1被認(rèn)為是PI3K/AKT信號通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖、遷移和凋亡中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

過度的細(xì)胞凋亡會破壞黏膜的完整性，最終導(dǎo)致黏膜損傷。凋亡抑制蛋白Bcl-2控制線粒體膜通透性，通過阻止細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中來抑制細(xì)胞凋亡。Bax是促凋亡的代表，具有與Bcl-2相反的功能，刺激凋亡小泡的形成，并最終激活凋亡執(zhí)行子Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。我們的研究表明，在乙醇誘導(dǎo)的GU大鼠胃組織中，促凋亡的Bax和胱天蛋白酶-3顯著增加，Bcl-2受到抑制，但LF激活了PI3K/AKT通路，隨后下調(diào)了Bax、胱天蛋白酶3的蛋白表達(dá)，并上調(diào)了Bcl-2。此外，TUNEL染色也證實(shí)了LF可以防止乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜細(xì)胞凋亡。上述證據(jù)表明，LF可能通過PI3K/AKT信號通路預(yù)防細(xì)胞凋亡損傷并維持胃黏膜完整性。

總之，LF通過減少氧化應(yīng)激和炎癥、調(diào)節(jié)代謝、抑制胃黏膜細(xì)胞凋亡，對GU發(fā)揮胃保護(hù)作用。更重要的是，LF通過抑制細(xì)胞凋亡和通過激活PI3K/AKT途徑維持胃黏膜完整性來改善乙醇誘導(dǎo)的GU。本研究對探討LF的抗胃潰瘍作用及其機(jī)制具有重要意義，提示其具有成為胃黏膜保護(hù)劑的潛力。