一、人類 BMOs的發(fā)展

通過遵循這些步驟，研究人員可以成功開發(fā)人類BMOs，這些BMOs是研究造血、建模疾病和可能推進治療干預的有價值工具。

圖1 生成源自人類 iPSC 的 BMOs，并通過流式細胞儀和顯微鏡分析細胞組成。a. BMO生成工作流程的示意圖。b. n=5獨立分化的第0天和第4天的iPSC1衍生的胚狀體、第6天的萌芽胚狀體以及第17天的分化BMO的代表性明場圖像。c. n=3獨立分化在第17天的流式細胞術數(shù)據(jù)的聯(lián)合t-SNE可視化，得到105,000個細胞。在t-SNE圖中顯示每個譜系標記物的表達。顏色與表達強度相關（紅色，高表達；藍色，低表達）。d. t-SNE投影上手動門控細胞群體的疊加。定義為內皮細胞（CD45-CD31+）、造血細胞（CD45+）、髓系細胞（CD45+CD11b+）和間充質細胞（CD45-CD31-CD271+）的亞群。HSPCs為CD45+CD11b-CD34+，MSPCs為CD45-CD31-CD271+CD90+CD105+CD73+。詳細的門控策略在擴展數(shù)據(jù)圖1a中概述。e. n=5獨立分化的手動門控細胞類型的頻率量化。數(shù)據(jù)表示為平均值±s.e.m。f，g. n=3獨立分化的排序和May-Gruenwald-Giemsa染色的HSPCs（f）和CD45+CD11b+髓系細胞（g）的代表性明場顯微鏡圖像。HSPCs的核質比高。CD11b+髓單核細胞，包括單核細胞（豆形核，淡色細胞質和細顆粒）和特征為帶狀核的不成熟中性粒細胞。h. 培養(yǎng)中MSPC的形態(tài)，通過相差顯微鏡觀察。使用iPSC1和iPSC2的n=6次代表性圖像。i. 使用雙光子顯微鏡對n=3獨立分化的代表性全組織器官（iPSC1，第21天）進行抗體染色分析。j. 從共聚焦圖像中得到的3D z-重建的表面渲染，顯示CD45+細胞在CD31+和CD271+生態(tài)位細胞中。k. 附加視頻5的靜止圖像。j的角度視圖，以可視化3D架構。比例尺：b，500?μm（第6天插圖為100?μm）；f-h，20?μm；i，100?μm；j，k，50?μm。

二、異質細胞類型組成

功能意義：BMOs的異質細胞類型組成，包括造血、內皮和間充質譜系，有助于其功能特性，如支持造血、血管網(wǎng)絡形成和基質相互作用的能力。

三、間質和血管空間結構

對造血支持的作用： BMOs中周血管基質細胞、周細胞和ECs之間的緊密相互作用對于支持造血、維持造血干細胞功能以及協(xié)調血細胞生產所需的微環(huán)境至關重要。

圖2 BMOs 的空間結構再現(xiàn)了間充質和血管人類 BM 龕的主要特征。a，BMO中CD31（ECs）和PDGFRβ（周細胞）免疫染色的共聚焦圖像，用于可視化血管網(wǎng)絡和PDGFRβ+周細胞。b，使用共聚焦顯微鏡分析分化第10天和第21天的周細胞-EC關聯(lián)。頂部，分化第10天的PDGFRβ+周細胞的指狀延伸。底部，分化第21天的一個PDGFRβ+周細胞與一個EC的緊密關聯(lián)。c，通過共聚焦顯微鏡觀察整個類器官中特定細胞亞群中CXCL12的表達。d，通過共聚焦顯微鏡分析緊鄰ECs的CXCL12表達周細胞。e，排列在CD31+血管和CD45+造血細胞上的Nestin+細胞。請注意帶有帶狀細胞核的CD45高表達細胞。f，通過雙光子顯微鏡分析Nestin表達與CD31+血管和CD45+造血細胞的空間關聯(lián)；z軸維度，515μm。g，通過共聚焦顯微鏡分析LepR表達。在a-g中，n=3次獨立實驗。h，間充質微環(huán)境細胞和血管的3D表面渲染。i，用于CD31染色的整個類器官的3D表面渲染；來自補充視頻4的靜止幀。j，ECs被Col IV+基底膜覆蓋。在i和j中，n=3次獨立實驗。k，通過透射電子顯微鏡（TEM）分析由緊密連接（TJ）連接的周細胞和EC。l，TEM分析類器官切片，顯示由EC（E）形成管腔（L）并由周細胞（P）包圍的類似毛細血管的結構；星號表示魏貝爾-帕拉德體。k和l是n=2次獨立實驗切片的代表性顯微照片。m，通過H/E染色，組織學切片顯示形態(tài)上類似于血管樣結構管腔內的造血細胞；n=3次獨立實驗。n，TEM分析類器官切片，顯示ECs（E）包圍著類似髓系細胞（M）的圓形細胞。來自n=2次獨立實驗切片的代表性顯微照片。o，通過3D渲染可視化血管腔內的造血細胞；來自補充視頻5的靜止幀。比例尺，a，f，i為100μm，i中的插圖為50μm；b-e為50μm；g，m為20μm；h，j為10μm；k為1μm；l，n為2μm；o為5μm。

四、MSPCs 和血管網(wǎng)絡的功能特性

對再生醫(yī)學的啟示：了解BMO中MSPC和血管網(wǎng)絡的功能特性對再生醫(yī)學和組織工程應用具有重要意義。

五、粒細胞生成

圖3 BMOs 是粒細胞生成的模型。a，通過流式細胞術在第21天對解離的BMO進行中性粒細胞分化分析的分選方案。b，從BMO來源的中性粒細胞直到成熟中性粒細胞狀態(tài)的不同中性粒細胞祖細胞階段的表面標記物表達直方圖。c，CD45+群體中中性粒細胞祖細胞亞群的頻率量化；n=6次獨立實驗。d，BMO來源的分選中性粒細胞祖細胞和成熟中性粒細胞樣細胞的May-Gruenwald-Giemsa染色。來自n=2次獨立實驗的代表圖像。e，f，具有帶狀/分段細胞核的細胞的S100A8/A9（e）和MPO（f）免疫染色的共聚焦成像。插圖，矩形區(qū)域的放大圖像。DAPI，4，6-二氨基-2-苯基吲哚。g，通過免疫組織化學對BMO截面的MPO表達進行分析。插圖，矩形區(qū)域的放大圖像。e-g中的圖像來自n=3次獨立實驗的代表圖像。h，類似于中性粒細胞顆粒細胞的細胞在類器官中的典型形態(tài)的透射電子顯微鏡圖像。來自n=2次獨立實驗切片的代表性微圖。i，用于模擬炎癥的實驗布局。ELISA，酶聯(lián)免疫吸附試驗。j，刺激和未刺激的BMO上清液中的細胞因子水平，LPS n=5次獨立實驗和Listeria（L. monocytogenes），n=3次獨立實驗。未刺激。k，BMO中PreNeu群體在刺激后的倍數(shù)變化量化；LPS，n=5次獨立實驗和Listeria n=3次獨立實驗。比例尺，d，20μm；e，f，10μm；g，50μm（插圖10μm）；h，2μm。c，j和k中的數(shù)據(jù)以平均值±s.e.m.表示。

六、通過單細胞轉錄組學分析細胞類型

圖4 BMO 的單細胞轉錄組分析確定了不同的細胞群。a，對單細胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)的粗粒度聚類揭示了主要由內皮細胞、造血細胞和間充質細胞組成的三個主要群體。b，表達指示三個主要群體的特征性標記。c，總數(shù)為31，040個細胞的統(tǒng)一流形逼近和投影（UMAP）投影，根據(jù)詳細的細胞類型注釋進行著色。eo/baso，嗜酸性粒細胞/嗜堿性粒細胞；GMP，粒細胞/單核細胞祖細胞；MPP，多能干細胞；LMPP，淋巴樣祖多能干細胞；MEP，巨核細胞/紅細胞祖細胞，MK，巨核細胞；單核。mac.，單核巨噬細胞；PS，原始條紋狀。d，用于造血譜系注釋的標記基因表達。Neutr.prog.，中性粒細胞祖細胞；mono.prog.，單核細胞祖細胞。e，用于內皮細胞亞型的標記基因表達。f，表達所示標記基因的動脈內皮細胞和pre-HE細胞的UMAP投影。g，用于間充質細胞群的標記基因表達。h，表達標記基因的不同間充質亞群的UMAP投影。

七、BMO中HSPC的特征

圖5 與胎兒造血干細胞相似的分子特征、BMO 衍生 HSPC 的淋巴潛能和移植潛能。a-c，BMO的scRNA-seq，揭示了典型、早期和決定性/表面HSC標記基因（a）、HSC的不成熟和成熟狀態(tài)的標記基因（b）以及指示成熟的HLA-II類分子基因（c）的表達。Hem.，造血。d，用BMO來源的CD34+細胞生成ATO的實驗布局，并通過流式細胞術進行分析。e，通過流式細胞術分析活細胞、CD14-、mCD29-、CD56+和CD45+細胞的表面標記表達。f，e中所示的淋巴細胞群體的頻率定量，n=3批獨立的BMO和ATO分化。g，測試體內植入潛能的實驗布局。h，移植后5、8、10和12周小鼠外周血中人類嵌合體的頻率定量。i，在移植了BMO來源的HSPC、臍帶血對照或非移植對照的小鼠的骨髓中，通過流式細胞術分析人類嵌合體（hCD45+細胞）。j，移植了BMO來源的HSPC后10和12周，小鼠骨髓中hCD45+細胞的頻率定量；n=2批獨立的BMO分化的獨立移植。k，BMO來源的HSPC移植和臍帶血對照的移植細胞中hCD45+細胞的表面標記表達的流式細胞術分析。l，在n=2批BMO來源的HSPC移植和n=4批臍帶血移植動物的骨髓中，移植的hCD45+細胞中hCD20+（B細胞）、hCD33+（髓系細胞）和hCD3+（T細胞）的頻率定量。f和l中的數(shù)據(jù)以平均值±s.e.m.表示。

八、造血發(fā)育和遺傳疾病建模

圖6 BMOs 造血發(fā)育和遺傳疾病的模型特征。a，UMAP投影顯示內皮細胞群中的前HE亞群。b，點圖顯示了在EHT期間動脈ECs、前HE、HE和HSPCs的關鍵標記基因的表達。c，點圖顯示了不同亞群中TGFβ/BMP或Wnt抑制劑基因的表達。d，使用FlowSOM算法對流式細胞術群體進行無監(jiān)督聚類，揭示了內皮細胞群的異質性。e，F(xiàn)lowSOM算法確定的BMO細胞群1-5中指示的表面標記表達的平均熒光強度（MFI）的熱圖。f，描述從HE到HSPCs轉變過程中形態(tài)變化的示意圖。g，通過共聚焦成像顯示RUNX1和CD31在細胞群中的共表達。RUNX1+細胞以圓形形態(tài)（箭頭）附著于內皮層。h，i，HE-（h）和CD34-（i）染色的類器官切片顯示造血細胞從內皮壁萌出。j，第10天BMO中CD31免疫染色的表面渲染。k，第10天BMO內血管腔中的CD31、CD34和CD45免疫染色的表面渲染；來自補充視頻7的靜止幀。g-k圖像是來自n=3次獨立實驗的代表圖像。l，在BMOs中模擬VPS45缺乏并進行后續(xù)分析。創(chuàng)建等基因VPS45突變iPS細胞系的基因編輯和實驗設置的示意圖。m，通過H/E和Gomori染色比較對照和VPS45突變BMOs的組織學特征，揭示VPS45突變BMOs中的網(wǎng)狀纖維化；每種條件的n=8個類器官，來自兩個批次。n，通過免疫熒光分析對照和VPS45-突變BMOs中的Alpha SMA表達。o，SMA表達的MFI的定量；每個條件的n=5個類器官的四個不同區(qū)域，來自兩個批次。****P<0.0001，未配對雙尾t檢驗。p，通過流式細胞術對成熟Neus上Annexin的平均熒光強度（MFI）進行量化；n=3次獨立實驗。*P=0.0155，未配對雙尾t檢驗。o和p中的數(shù)據(jù)以平均值±標準誤差（s.e.m.）表示。比例尺，g，j，20μm；h，i，m，n，50μm；k，8μm。

本研究利用人工誘導多能干細胞（iPSCs）生成的骨髓類器官（BMOs）在模擬造血發(fā)育和遺傳疾病建模方面的應用。BMOs能模擬人類骨髓微環(huán)境，生成具有造血潛能的細胞群，并可用于研究造血發(fā)育機制、疾病發(fā)病機理及潛在治療策略。此外，BMOs為個性化醫(yī)學提供了可能，可定制實驗以探索個性化治療干預措施。總之，BMOs在造血系統(tǒng)疾病研究和精準醫(yī)學中具有重要價值。

參考信息

Generation of complex bone marrow organoids from human induced pluripotent stem cells.Nat Methods. 2024 Feb 19. doi: 10.1038/s41592-024-02172-2.PMID: 38374263.