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期刊：Science

哺乳動(dòng)物的大腦控制感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能，維持生理穩(wěn)態(tài)，支持認(rèn)知和記憶功能。單細(xì)胞測(cè)序揭示了整個(gè)小鼠大腦以及人類大腦區(qū)域中廣泛的細(xì)胞類型多樣性。本研究對(duì)來(lái)自男性供體的三個(gè)完整人腦組織進(jìn)行了單核RNA測(cè)序（圖1A）。研究的目的是在技術(shù)重復(fù)上從三個(gè)大腦中100個(gè)解剖學(xué)上不同的位置（解剖）取樣（表S1）。研究還納入了先前發(fā)表的一篇女性供體的運(yùn)動(dòng)皮層解剖數(shù)據(jù)（M1C；兩次技術(shù)重復(fù)，55591個(gè)細(xì)胞）。研究最終納入了606個(gè)高質(zhì)量樣本，涵蓋了從4個(gè)大腦中獲得的橫跨10個(gè)大腦區(qū)域的105個(gè)解剖（圖S1和表S2）。

研究使用基于圖的聚類將細(xì)胞分層劃分為31個(gè)超簇，461個(gè)簇，3313個(gè)子簇（圖1B至D）。除了一個(gè)例外，作者根據(jù)文獻(xiàn)及其區(qū)域組成（表S3）命名了超簇。一個(gè)超簇包含來(lái)自大多數(shù)大腦區(qū)域的神經(jīng)元，作者僅根據(jù)它們?cè)诙S圖中的外觀將這些神經(jīng)元命名為splatter神經(jīng)元（圖1B）。所有簇的樹(shù)突圖反映了之前的小鼠研究:神經(jīng)元從非神經(jīng)元細(xì)胞分裂成兩個(gè)主要分支（圖1E）：一個(gè)分支包含表達(dá)SLC17A7的端腦興奮性神經(jīng)元；另一個(gè)包含端腦抑制性神經(jīng)元（SLC32A1+）以及所有興奮性和抑制性間腦、中腦和后腦神經(jīng)元（圖1E）。

圖1.成人大腦的單核RNA測(cè)序。（A）解剖示意圖。縮寫對(duì)應(yīng)于Allen腦參考圖譜或皮質(zhì)Brodmann區(qū)域。（B）t-SNEs顯示神經(jīng)元（右）和非神經(jīng)元細(xì)胞（插圖，左）按超簇著色。CA，海馬區(qū)；CGE，尾側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起；CT，皮質(zhì)丘腦的；DG，齒狀回；IT，端腦內(nèi)側(cè)束；NP，近投射；MGE，內(nèi)側(cè)神經(jīng)節(jié)突起；MSN，中棘神經(jīng)元；OPC，少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。（C）與（B）相同顏色的堆疊條形圖，表示每個(gè)超簇中的細(xì)胞數(shù)量。（D）直方圖顯示每個(gè)超簇、簇或亞簇中細(xì)胞數(shù)量的分布。（E）461個(gè)簇的樹(shù)突圖，從上到下為細(xì)胞數(shù)；顏色飽和度表示來(lái)自每個(gè)大腦區(qū)域的每簇細(xì)胞的比例；超簇著色如（B）所示；熱圖顯示神經(jīng)元（INA）、谷氨酸能（SLC17A6、SLC17A7）和GABA能（SLC32A1）神經(jīng)元、免疫細(xì)胞（PTPRC）、血管細(xì)胞（CLDN5、ACTA2）、成纖維細(xì)胞（LUM）、OPCs（PDGFRA、SOX10）、少突膠質(zhì)細(xì)胞（SOX10、PLP1）、星形膠質(zhì)細(xì)胞（AQP4）、室管膜細(xì)胞（FOXJ1）和脈膜叢（FOXJ1、TTR）的基因表達(dá)；灰度表示來(lái)自每個(gè)供體的每簇細(xì)胞的比例；柱狀圖表示每個(gè)簇的亞簇?cái)?shù)。

1   超簇的分布反映了大腦發(fā)育

超簇在不同解剖之間的分布可能反映了它們的發(fā)育歷史（圖2A）。大多數(shù)超簇來(lái)源于端腦，這表明作者對(duì)該發(fā)育區(qū)室的采樣深度與其復(fù)雜性有關(guān)。幾個(gè)超簇對(duì)應(yīng)于大腦皮層六層興奮性神經(jīng)元：顱內(nèi)（IT）投射區(qū)[上層和深層IT（斜體表示超簇名稱）]，近投射（NP）（深層NP）和皮質(zhì)-丘腦投射區(qū)（CT/6b）（深層CT/6b）。上層IT和深層IT超簇均包含潛在的第四層簇。潛在的第五層顱外（ET）投射區(qū)神經(jīng)元與淋巴細(xì)胞和其他罕見(jiàn)的細(xì)胞類型（約25000個(gè)細(xì)胞）均屬于雜項(xiàng)。兩個(gè)超簇對(duì)應(yīng)于大腦核內(nèi)表達(dá)多巴胺受體的中棘神經(jīng)元（MSNs）和CASZ1+偏心MSNs（圖2A，圖S2A至F）。大多數(shù)偏心MSNs僅表達(dá)DRD1，但基底節(jié)中的許多神經(jīng)元共表達(dá)DRD1和DRD2，這表明了區(qū)域特化（圖S2G和H）。大多數(shù)其他超簇是特定于區(qū)域的興奮性神經(jīng)元。

圖2.超簇和簇在大腦區(qū)域的分布是不同的。（A）不同解剖的超簇分布，按列歸一化，按區(qū)域著色（灰色，潛在的標(biāo)簽跳躍和解剖不精確）。（B）皮層解剖按葉著色，并與兩個(gè)具有最相似簇比例的解剖相連。（C）熱圖顯示解剖之間的簇比例的相關(guān)性，在兩個(gè)軸上的順序相同。（左）顏色條表示皮層葉，顏色與（B）相同。（D）每個(gè)簇的堆疊條形圖（不包括少于100個(gè)細(xì)胞或少于1%的皮層細(xì)胞的簇）顯示每個(gè)皮層解剖的神經(jīng)元的相對(duì)貢獻(xiàn)，按圖例著色。UMAP嵌入圖顯示了選擇的細(xì)胞簇（灰色，非皮層細(xì)胞）。簇被標(biāo)記為兩個(gè)最豐富的基因。紅色標(biāo)簽，γ-氨基丁酸能（SLC32A1）；藍(lán)色標(biāo)簽，興奮性谷氨酸（SLC17A6或SLC17A7）。

三個(gè)超簇存在于多個(gè)區(qū)域可能反映了發(fā)育過(guò)程中的遷移。首先，皮層間神經(jīng)元分布在端腦上，反映它們從內(nèi)側(cè)和尾側(cè)神經(jīng)節(jié)突起（分別是MGE和CGE間神經(jīng)元）遷移而來(lái)。研究數(shù)據(jù)表明，CGE間神經(jīng)元的遷移范圍更廣，包括下丘腦、丘腦和中腦。這個(gè)觀察結(jié)果可能反映了發(fā)育過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄組趨同—LHX6在下丘腦產(chǎn)生局部抑制性神經(jīng)元—但從神經(jīng)節(jié)突起向丘腦的遷移只發(fā)生在人類身上。其次，主要出現(xiàn)在丘腦和中腦的超簇可能對(duì)應(yīng)于SOX14+抑制性神經(jīng)元，它們從胚胎中腦遷移到丘腦。研究數(shù)據(jù)表明，其中一些細(xì)胞也會(huì)遷移到下丘腦和腦橋；作者通過(guò)原位雜交證實(shí)了后者（圖S3）。第三，兩個(gè)超簇似乎來(lái)自菱形腦唇，它不僅產(chǎn)生小腦，還產(chǎn)生遷移到腦橋和延髓特定細(xì)胞核的神經(jīng)元。

2   解剖揭示腦區(qū)內(nèi)超簇特有的解剖學(xué)多樣性

由于超簇富集在特定的發(fā)育區(qū)域和區(qū)域，研究想知道解剖關(guān)聯(lián)是否也可以解釋超簇內(nèi)的異質(zhì)性。如預(yù)期的那樣，端腦興奮性神經(jīng)元變化遠(yuǎn)大于中間神經(jīng)元。然而，即使是一些廣泛分布的簇在解剖上的分布也是不均勻的。為了確定簇是否按照系統(tǒng)規(guī)則分布，作者研究了相同區(qū)域內(nèi)的解剖之間的關(guān)聯(lián)。研究分別計(jì)算了大腦皮層、大腦核和丘腦的鄰域圖，并將每個(gè)解剖與具有最相似簇比例的兩個(gè)解剖連接起來(lái)。解剖通常與鄰近的解剖相連，這表明細(xì)胞類型組成在整個(gè)發(fā)育區(qū)域中廣泛反映了空間位置（圖2B）。盡管不精確的解剖可能在一定程度上推動(dòng)了大腦細(xì)胞核和丘腦的這種結(jié)果，但更明確的皮層解剖也以類似的方式排列（圖2B）。

然而，超簇可能在腦區(qū)內(nèi)分布不同。因此，研究者分別比較了每個(gè)超簇內(nèi)的解剖，重點(diǎn)關(guān)注皮層，因?yàn)樗慕馄屎统財(cái)?shù)量相對(duì)較多。鄰近的解剖仍然具有廣泛的相關(guān)性，但超簇展現(xiàn)了不同的相關(guān)模式，并且并非總是平滑地分布在整個(gè)大腦中（圖2C）。興奮性神經(jīng)元產(chǎn)生不同的模式，這意味著不同程度的解剖特化。上層IT神經(jīng)元表現(xiàn)最為特化，并在許多解剖組中明顯分布，如布羅德曼區(qū)44至46（A44-A45、A46）、額葉島和前扣帶回皮層（FI、A24）、運(yùn)動(dòng)皮層（M1C）和體感皮層（S1C）以及視覺(jué)皮層（V1C）。深層NP神經(jīng)元以兩種主要模式分布，在頂葉皮層分裂。一些解剖始終分組在一起，包括FI和A24，以及A44-A45和A46。內(nèi)嗅皮層和古皮層（內(nèi)嗅皮層（MEC）、外嗅皮層（LEC）、梨狀皮層（Pir）、前嗅核（AON）），被認(rèn)為是皮層中進(jìn)化上更保守的部分，只包含三個(gè)細(xì)胞層。

接下來(lái)，研究探討特定簇是否推動(dòng)了這些相關(guān)模式。大多數(shù)間神經(jīng)元簇對(duì)所有皮層解剖都有貢獻(xiàn)（圖2D），但一些興奮性神經(jīng)元簇在特定的解剖中富集，這也解釋了先前的觀察結(jié)果。M1C和S1C共享兩個(gè)上層IT簇（編號(hào)128和131），這可能推動(dòng)了它們?cè)谶@個(gè)超簇中的高相關(guān)性以及它們?cè)卩徲驁D中緊密的關(guān)系（圖2B、D）。V1C表現(xiàn)出獨(dú)特的深層CT/6b和上層IT簇（編號(hào)107和133），包括V1C特有的TRPC3+第四層神經(jīng)元。內(nèi)嗅皮層和梨狀皮層包含獨(dú)特的深層IT和深層CT/6b簇以及杏仁核興奮性神經(jīng)元和間神經(jīng)元簇（圖2B和D）。然而，在FI和A24或A44-A45和A46中沒(méi)有獨(dú)特的富集簇，這表明這些高度相關(guān)的解剖反而包含了相似比例的更廣泛分布的簇。

在皮層之外，超簇和簇也根據(jù)不同的模式區(qū)分解剖。一些超簇分布相對(duì)廣泛，包括遷移的MGE和CGE間神經(jīng)元和產(chǎn)生于中腦的抑制性神經(jīng)元。相比之下，許多區(qū)域特異性超簇在特定的核中富集。許多杏仁核核團(tuán)包含相對(duì)特異的杏仁核興奮性神經(jīng)元簇。紋狀體（尾狀核（CaB）、伏隔核（NAc）和殼核（Pu））包含相對(duì)特定的MSN簇。丘腦興奮性神經(jīng)元簇在外側(cè)膝狀體（LG）和前核復(fù)合體（ANC）中高度富集。即使在這些超簇中，許多簇也出現(xiàn)在多個(gè)解剖中（圖S4A和S5）。由于這些區(qū)域的解剖通常重疊，未來(lái)的工作可能會(huì)將更多的細(xì)胞類型定位到特定的細(xì)胞核。然而，研究觀察結(jié)果表明，由于細(xì)胞類型組成的差異和特殊細(xì)胞類型的存在，個(gè)體腦細(xì)胞核在轉(zhuǎn)錄上是有所不同的。

3   大部分的神經(jīng)元多樣性存在于端腦之外

Splatter神經(jīng)元由來(lái)自大多數(shù)大腦區(qū)域的一組異質(zhì)細(xì)胞組成，特別是中腦、后腦和超過(guò)一半的下丘腦神經(jīng)元（圖3A和圖S6A）。只有一個(gè)Splatter簇包含來(lái)自皮層的細(xì)胞，可能代表遠(yuǎn)距離投射的γ-氨基丁酸釋放（GABA能）神經(jīng)元（圖2D；編號(hào)235表達(dá)SST和CHODL）。超簇表達(dá)多種神經(jīng)遞質(zhì)，包括抑制性和興奮性細(xì)胞，22%表達(dá)GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體SLC32A1，39%表達(dá)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體SLC17A6，1.4%共同表達(dá)這些基因（圖3B、C），以及乙酰膽堿能、甘氨酸能、5-羥色胺能和多巴胺能神經(jīng)元。這表明相對(duì)于其他超簇來(lái)說(shuō)，Splatter神經(jīng)元的復(fù)雜性更高，92個(gè)Splatter簇共產(chǎn)生了1145個(gè)子簇，超過(guò)任何其他超簇的900多倍（圖3）。此外，描述Splatter神經(jīng)元所需的主成分?jǐn)?shù)量幾乎增加了一倍（圖3E）。

圖3.Splatter神經(jīng)元是高度復(fù)雜的。（A）Splatter神經(jīng)元在t-SNE上按簇著色。（B和C）通過(guò)表達(dá)圖例中表達(dá)最高的基因而著色的細(xì)胞（灰色，無(wú)表達(dá)）。箭頭表示具有高AVP和SLC5A7表達(dá)的簇。（D）對(duì)于每個(gè)超簇或子集，簇大小中值（左）或子簇總數(shù)（右）根據(jù)簇總數(shù)繪制。Splatter是橙色的。（E）代表每個(gè)超簇的主成分的最佳數(shù)量，分別為每個(gè)供體計(jì)算。5-羥色胺能和多巴胺能指示Splatter亞群。（F）來(lái)自臂旁核的細(xì)胞在t-SNE中按超簇染色和標(biāo)記。（G）細(xì)胞與其25個(gè)最近鄰之間的歐幾里得距離分布，通過(guò)每個(gè)數(shù)據(jù)集的最大距離進(jìn)行歸一化。（H）來(lái)自臂旁核的Splatter細(xì)胞在t-SNE按亞簇著色。（I）與（B）相同。（J）5-羥色胺能神經(jīng)元在t-SNE上按簇著色。（K）包括（J）中所示5-羥色胺能神經(jīng)元95%的解剖。節(jié)點(diǎn)大小表示每個(gè)解剖的細(xì)胞數(shù)量，邊緣寬度表示相鄰細(xì)胞的百分比。（L）選擇基因在5-羥色胺能細(xì)胞中的表達(dá)。（頂條）亞簇著色如（J）所示。（第二條）區(qū)域著色如（K）所示。（M）TH+和多巴胺能神經(jīng)元按亞簇著色。（N）與（K）相同，但針對(duì)TH+神經(jīng)元。（O）與（B）相同。（P）由顏色和標(biāo)記基因指示的更精細(xì)的亞型。

另外，主成分并沒(méi)有揭示出超簇的明顯分層結(jié)構(gòu)，而是主要區(qū)分了一個(gè)特定的端腦亞型。即使在解剖中，與皮層解剖相比，Splatter富集區(qū)域的第一成分與神經(jīng)遞質(zhì)的相關(guān)性較低，即使單獨(dú)分析Splatter神經(jīng)元時(shí)也是如此（圖S6H和I）。研究探索了這種非典型分子結(jié)構(gòu)是否是本文方法的人為產(chǎn)物，并觀察到Splatter神經(jīng)元在不同供體保持一致，在質(zhì)量指標(biāo)上并沒(méi)有突出表現(xiàn)。在下采樣后，Splatter神經(jīng)元一致地分組在一起，沒(méi)有供體批次校正，并且具有不同的基因集（圖S6L和M）。此外，高斯混合模型（GMM）獨(dú)立于細(xì)胞鄰域圖將Splatter神經(jīng)元聚集在一起，這意味著這些細(xì)胞占據(jù)不同的轉(zhuǎn)錄子空間（圖S7A）。

因此，研究使用了一種替代因子分解方法來(lái)鑒定這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄模塊。主題建模[潛在狄利克雷分配（LDA）]發(fā)現(xiàn)了一個(gè)富含Splatter的模塊，該模塊包括神經(jīng)元活性相關(guān)基因，包括5-羥色胺能受體HTR2C、電壓門控通道SCN7A和SCN9A以及肌動(dòng)蛋白組織蛋白KLHL1（圖S7B和C）。然而，這些基因并不是高度特異性的，LDA模型適合較少的主題分組Splatter神經(jīng)元與其他超簇（圖S7D）。因此，研究假設(shè)其他一些超簇與Splatter神經(jīng)元相似但更豐富，這樣更容易通過(guò)聚類分析分離。為了驗(yàn)證這一想法，研究重新分析了一個(gè)下采樣的數(shù)據(jù)集，但只保留了五個(gè)乳頭體神經(jīng)元，LDA將其與Splatter神經(jīng)元分組。這五個(gè)細(xì)胞與Splatter神經(jīng)元聚集（圖S7E）。因此，大多數(shù)非端腦神經(jīng)元第二相似于Splatter神經(jīng)元。這些觀察結(jié)果表明，Splatter神經(jīng)元包括多種未被深度采樣的非端腦細(xì)胞類型，在當(dāng)前數(shù)據(jù)集中無(wú)法很好地建模。如果更深入地采樣，一些神經(jīng)元類型可能會(huì)形成自己的超簇；當(dāng)研究者按簇對(duì)整個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行下采樣時(shí)，Splatter神經(jīng)元相對(duì)更常見(jiàn)，并在嵌入上表現(xiàn)出更多結(jié)構(gòu)（圖S6L）。

因此，通過(guò)探究亞簇可能會(huì)更好地理解這個(gè)超簇。研究首先探究了這些神經(jīng)元在特定解剖中是否沒(méi)那么復(fù)雜，并分析了臂旁核，在那里作者對(duì)高比例的Splatter神經(jīng)元進(jìn)行了采樣。研究發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)生于中腦的抑制性神經(jīng)元、上菱形唇、下菱形唇、小腦抑制和Splatter神經(jīng)元（圖3F）。Splatter神經(jīng)元的異質(zhì)性最強(qiáng)，與其他超簇的神經(jīng)元相比，它們與25個(gè)最近鄰的距離更大，其他超簇的距離更像皮層神經(jīng)元之間的距離（圖3G）。作者在臂旁核中發(fā)現(xiàn)了147個(gè)具有5個(gè)以上細(xì)胞的Splatter亞簇（圖3H）。這些亞簇跨越已知鄰近（PHOX2B+）的群體，并在空間上分離于（FOXP2+，LMX1B+和PAX5+）小鼠臂旁核內(nèi)。在研究數(shù)據(jù)中，NR4A2和LMX1A更特異性地標(biāo)記了FOXP2+和LMX1B+神經(jīng)元（圖3I）。因此，臂旁細(xì)胞類型非常多樣化，但在小鼠和人類中廣泛保守。

研究還探索了根據(jù)神經(jīng)遞質(zhì)類型定義的Splatter簇，如5-羥色胺。5-羥色胺能標(biāo)記物FEV和SLC6A4在簇397中高表達(dá)，簇397包括14個(gè)亞簇，主要來(lái)源于腦橋、中腦、髓質(zhì)和下丘腦（圖3J和K）。所有細(xì)胞都表達(dá)FEV，除了一小部分20 PAX6+細(xì)胞和一些PITX2+下丘腦細(xì)胞（圖3L）。正如在小鼠中先前描述的那樣，亞簇可以分為顱前（HMX3+）和顱后（HOX+）衍生群體，并且顱前神經(jīng)元可以進(jìn)一步分為EN1+和EN1-群體。與最近的小鼠單細(xì)胞研究類似，研究分析揭示了谷氨酸能和GABA能基因以及肽類如PENK和TRH的組合表達(dá)（圖3）。研究分析中的一個(gè)亞簇似乎對(duì)應(yīng)于小鼠近腦導(dǎo)水管處分布的P2RY1+MET+TACR3+細(xì)胞，該亞簇主要來(lái)自周圍灰質(zhì)，這表明這些神經(jīng)元及其特定的電生理和投射屬性在人類中也是保守的。

接下來(lái)，作者研究了表達(dá)多巴胺能標(biāo)記TH、SLC6A3和DDC的Splatter簇，該簇主要包含中腦—黑質(zhì)、紅核和中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)—以及極少數(shù)下丘腦神經(jīng)元（圖3M和N，以及圖S8，J到N）。該分析產(chǎn)生了三個(gè)神經(jīng)元類別（TH+SOX6+、TH+CALB1+和TH+GAD2+）和14個(gè)亞型（圖3O和P）。作者在最近的數(shù)據(jù)集上訓(xùn)練了一個(gè)分類器，該數(shù)據(jù)集定義了黑質(zhì)NR4A2+核中的10個(gè)亞型和兩類多巴胺能神經(jīng)元（TH+SOX6+和TH+CALB1+）。研究發(fā)現(xiàn)，14種神經(jīng)元亞型中有7種對(duì)應(yīng)于之前定義的8種多巴胺能神經(jīng)元亞型（圖S8P至S）。兩個(gè)數(shù)據(jù)集的整合分析證實(shí)了這些結(jié)果以及七種額外神經(jīng)元亞型的存在（圖S8、T至V以及材料和方法），包括一種黑質(zhì)（TH+SOX6+LPL+）和紅核周圍的中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)和腹側(cè)被蓋區(qū)中的四種TH+CALB1+亞型（PAX5+、NPW+、GCCR+或VIP+）（圖3P和圖S8O）。與5-羥色胺能神經(jīng)元類似，中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)中的TH+CALB1+亞型表達(dá)不同的神經(jīng)肽組合，如VIP、NPPC、NPW和PENK（圖S8W）。此外，研究發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)TH+GAD2+簇（CALCR+或EBF2+），它們定義了共表達(dá)一些多巴胺能和GABA能標(biāo)記物的第三類神經(jīng)元的分子特征（圖S8O和X）。因此，研究結(jié)果與中腦TH+神經(jīng)元表現(xiàn)出的轉(zhuǎn)錄譜一致，這些轉(zhuǎn)錄譜包含完整的多巴胺能表型（TH+SOX6+和TH+CALB1+類的12個(gè)亞型）到具有部分多巴胺能和GABA能表型的TH+神經(jīng)元（TH+GAD2+類的兩種亞型）。

因此，即使是Splatter亞型也表現(xiàn)出廣泛的區(qū)域和分子異質(zhì)性。事實(shí)上，盡管僅包含約1000個(gè)細(xì)胞（圖3E），5-羥色胺能神經(jīng)元和多巴胺能神經(jīng)元表現(xiàn)出與一些超簇相似的復(fù)雜性。類似地，增強(qiáng)電熒光原位雜交（EEL-FISH）揭示了中腦和腦橋中表達(dá)多種神經(jīng)肽的GABA能和谷氨酸能神經(jīng)元（圖S9、B和C:B1-13、C1；以及圖S10）。研究還觀察到一些非常罕見(jiàn)的細(xì)胞群：在黑質(zhì)網(wǎng)狀部，發(fā)現(xiàn)共表達(dá)GHR和SST的細(xì)胞（圖S9A:A4），而在后紅核區(qū)域，發(fā)現(xiàn)了表達(dá)肽如ADCYAP1、CARPT、NPX或NTS的細(xì)胞（圖S9B:B10-12）。因此，腦干中的細(xì)胞是由神經(jīng)肽和神經(jīng)遞質(zhì)的組合表達(dá)來(lái)定義的。

研究觀察結(jié)果表明，Splatter神經(jīng)元聚集在一起是因?yàn)槎四X外的神經(jīng)元（i）與端腦神經(jīng)元的低相似性，以及（ii）不按神經(jīng)遞質(zhì)特性進(jìn)行分級(jí)組織。這種相似性很弱，并不意味著屬于生物學(xué)范疇。先前研究的年輕小鼠大腦圖譜沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何類似的Splatter簇。然而，當(dāng)作者將最初被排除在該數(shù)據(jù)集中的細(xì)胞包括在內(nèi)時(shí)，研究觀察到皮層和海馬體外的Splatter神經(jīng)元（圖S11A至C）。該群體包括相鄰的谷氨酸能、GABA能和甘氨酸能亞群，這些亞群表達(dá)了作者的LDA模型在Splatter神經(jīng)元中排名很高的基因（圖S11D）。這些神經(jīng)元以前可能被排除是因?yàn)樗鼈內(nèi)狈γ黠@的標(biāo)記物，因?yàn)榇蠖鄶?shù)神經(jīng)元的質(zhì)量與其他小鼠神經(jīng)元相似（圖S11E）。相應(yīng)地，如下丘腦視前區(qū)一樣，小鼠的一些區(qū)域也具有高度的異質(zhì)性。這些結(jié)果和作者的發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了哺乳動(dòng)物大腦包含高度多樣化的群體，需要更深入的采樣才能進(jìn)行聚類和分層組織。

4   少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞是大腦區(qū)域特有的

少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系超簇包括少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPCs）、定向分化的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（COPs）和少突膠質(zhì)細(xì)胞，并在一個(gè)單一的統(tǒng)一流形逼近與投影（UMAP）圖中呈現(xiàn)出類似分化的特點(diǎn)（圖4A）。如前所述，樹(shù)狀圖將八個(gè)少突膠質(zhì)細(xì)胞簇分為兩種類型，表達(dá)OPALIN或RBFOX1（分別為Oligo1和Oligo2）（圖4B和C）。一個(gè)明顯的RBFOX1+簇主要（88%）來(lái)源于一個(gè)供體的單個(gè)解剖，可能質(zhì)量較低（圖S12B至F）。RBFOX1+少突膠質(zhì)細(xì)胞先前被認(rèn)為是成熟的終態(tài)，與作者分析它們?cè)赨MAP的位置表現(xiàn)一致。

圖4.少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系。（A）UMAP圖上的少突膠質(zhì)細(xì)胞（桔黃色虛線下方的RBFOX1+）、COPs和OPCs，按簇灰度著色。餅狀圖顯示區(qū)域構(gòu)成。（B）t-SNE重嵌入的1型和2型少突膠質(zhì)細(xì)胞（左）。差異基因表達(dá)（右）（橙色線，q＜10^-5）。y軸表示調(diào)整后P值的-log₁₀。（C）按基因表達(dá)著色的少突膠質(zhì)細(xì)胞。（D）與（B）相同，但適用于OPCs。（E）OPC基因表達(dá)。（F）在每個(gè)區(qū)域發(fā)現(xiàn)的1型和2型少突膠質(zhì)細(xì)胞和OPCs的比例，按（A）著色。（G至I）按區(qū)域著色的解剖，如（A）所示。（左）端腦。（右）大腦的其余部分?？v軸表示解剖中循環(huán)OPCs的百分比（G），COPs與OPCs的比例（H），或少突膠質(zhì)細(xì)胞與OPCs的比例（I）。星號(hào)表示顯著差異（Mann-Whitney，P＜10^-4）。（G）中的y軸被裁剪為0.01；一個(gè)端腦解剖含有0.04%的循環(huán)細(xì)胞。（J）EEL分析每個(gè)解剖中少突膠質(zhì)細(xì)胞與OPCs的比值；SN-RN起源于前部位置。

四個(gè)OPC簇的特征是區(qū)域特異性，而不是成熟狀態(tài)（圖4A和圖S12G和S13）。兩種主要類型，OPC1和OPC2（圖4D和E），分別在端腦內(nèi)外富集，可能對(duì)應(yīng)于最近描述的NELL1+皮層和PAX3+脊髓群體。一個(gè)OPC2簇的54%是乳頭體核，類似于少突膠質(zhì)細(xì)胞簇（圖S13C至E）。OPC1和OPC2差異表達(dá)128個(gè)基因，在任一群體中變化超過(guò)四倍，包括軸突引導(dǎo)分子、區(qū)域特異性轉(zhuǎn)錄因子和Notch信號(hào)（圖S13A和表S6）。盡管作者之前在年輕小鼠中只發(fā)現(xiàn)了一個(gè)OPC簇，但重新分析顯示，小鼠OPCs相互排斥地表達(dá)類型特異性標(biāo)記物Hes5和Irx5（圖S13B）。因此，OPCs表現(xiàn)出相對(duì)較小的轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化—很少有主要成分解釋了它們的大部分變化（圖3E）—但在整個(gè)大腦中并不是同質(zhì)的。因此，OPC1內(nèi)的聚類似乎是由兩個(gè)表達(dá)梯度驅(qū)動(dòng)的。端腦特異性轉(zhuǎn)錄因子FOXG1在OPC1中均勻表達(dá)，而分泌蛋白NELL1和細(xì)胞粘附分子CNTN5平穩(wěn)增加（圖S13F至I）。第二個(gè)梯度由蛋白聚糖GPC5定義，GPC5是灰質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物（圖4E）。因此，端腦OPC的異質(zhì)性可能反映了與局部環(huán)境的相互作用。

所有區(qū)域都含有大量的兩種少突膠質(zhì)細(xì)胞，但不是兩種OPC類型，這與OPC1生成Oligo1和OPC2生成Oligo2的簡(jiǎn)單模型相矛盾。例如，OPC1在間腦中大部分缺失，但Oligo1和Oligo2都存在。然而，少突膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出區(qū)域差異:Oligo1在端腦中占優(yōu)勢(shì)；Oligo2細(xì)胞逐漸向大腦后部區(qū)域增加（圖4F）。由于Oligo1也被認(rèn)為比Oligo2更不成熟，作者研究了OPCs和少突膠質(zhì)細(xì)胞沿前后軸的差異分布是否可能部分反映了端腦內(nèi)外少突膠質(zhì)細(xì)胞的不同周轉(zhuǎn)速率。端腦OPCs比非端腦OPCs表達(dá)更多的細(xì)胞周期相關(guān)基因，這表明其增殖情況（圖4G）。

因此，作者研究了解剖中OPC、COP和少突膠質(zhì)細(xì)胞群體的比例，推斷這些比例可以反映相對(duì)周轉(zhuǎn)率。研究發(fā)現(xiàn)端腦中COPs相對(duì)于OPCs的比例升高，這表明分化開(kāi)始的頻率更高（圖4H）。相反，腦干中少突膠質(zhì)細(xì)胞相對(duì)于OPCs的比例更高（圖4I；由圖4J中的EEL-FISH證實(shí)），這表明成熟細(xì)胞相對(duì)于祖細(xì)胞群體的周轉(zhuǎn)率較低。因此，在研究的數(shù)據(jù)集中，與少突膠質(zhì)細(xì)胞相比，端腦OPCs顯示出更具增殖性，分化更頻繁，并形成更大的群體。因此，OPC增殖增加可能更頻繁地補(bǔ)充端腦中的少突膠質(zhì)細(xì)胞群，降低更成熟的Oligo2細(xì)胞的比例。然而，Oligo2并沒(méi)有被實(shí)驗(yàn)證實(shí)是一種成熟的終態(tài)，且OPCs在大腦中發(fā)揮著多種作用。這些比例可能反映其他區(qū)域的差異。

正如預(yù)期的那樣，星形膠質(zhì)細(xì)胞比少突膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出更明顯的區(qū)域異質(zhì)性。小鼠有兩種主要的星形膠質(zhì)細(xì)胞類型—端腦型和非端腦型—它們包含灰質(zhì)（Gfap陰性）和白質(zhì)（Gfap陽(yáng)性）亞型。作者發(fā)現(xiàn)這種分子結(jié)構(gòu)在人類中是保守的：13個(gè)星形膠質(zhì)細(xì)胞簇被分為端腦型和非端腦型（分別為1型和2型），每個(gè)都包含GFAP低和高群體（圖5A和B以及圖S14）。1型包括已知的人類皮層群體：WIF1+灰質(zhì)、TNC+白質(zhì)和LMO2+層間星形膠質(zhì)細(xì)胞。層間星形膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的特征。

圖5.星形細(xì)胞多樣性。（A至D）t-SNE顯示兩種主要的星形膠質(zhì)細(xì)胞類型（A）；GFAP表達(dá)（B）；WIF1、LMO2和TNC中表達(dá)最高的基因（C）；以及起源區(qū)域（D）中表達(dá)最高的基因。（E）星形膠質(zhì)細(xì)胞多樣性的腦區(qū)相似性。節(jié)點(diǎn)大小表示細(xì)胞數(shù)量，邊緣寬度表示相鄰區(qū)域或解剖中細(xì)胞的百分比。BNST，終紋床核；SEP，隔核；SI，無(wú)名質(zhì)和附近的細(xì)胞核。（F到H）（左）細(xì)胞在LDA主題上的得分如（B）所示。（中心）每個(gè)區(qū)域的得分分布如（D）所示。y軸修剪為5。（右）代表性基因表達(dá)。

然而，研究數(shù)據(jù)揭示了額外的區(qū)域異質(zhì)性，星形膠質(zhì)細(xì)胞亞型根據(jù)發(fā)育和解剖區(qū)段進(jìn)行組織（圖5D和E，以及圖S14D至F）。與皮層神經(jīng)元相對(duì)應(yīng)，灰質(zhì)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞包括兩個(gè)分別富集于新皮層、內(nèi)嗅皮層和梨狀皮層的兩個(gè)簇（編號(hào)52和編號(hào)54）。前者特異于皮層，后者也存在于海馬體和杏仁核。紋狀體星形膠質(zhì)細(xì)胞形成了自己獨(dú)特的簇（編號(hào)55）。蒼白球星形膠質(zhì)細(xì)胞類似于中腦和丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞，因此代表了唯一主要的端腦2型細(xì)胞（圖S14F）；其他2型細(xì)胞來(lái)源于間腦、中腦和后腦。LDA揭示了額外的與簇正交的異質(zhì)性，包括在蒼白球富集的主題，并且以FOS和JUN表達(dá)為代表（圖5F至H，以及圖S15）。這些基因是包括缺血在內(nèi)的許多細(xì)胞過(guò)程的下游，這表明病理?xiàng)l件驅(qū)動(dòng)了許多蒼白球星形膠質(zhì)細(xì)胞的分類。另外兩個(gè)主題由反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的潛在標(biāo)記物代表（圖5H和圖S15D）。總之，這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了星形膠質(zhì)細(xì)胞的區(qū)域異質(zhì)性和它們對(duì)環(huán)境反應(yīng)的不同分子程序。

在本研究中，作者提供了整個(gè)大腦轉(zhuǎn)錄組多樣性的概述。未來(lái)的工作必須弄清楚這些不同的轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)是否表現(xiàn)出不同的表觀基因組和功能特性。本研究強(qiáng)調(diào)了與分析人體組織相關(guān)的一些挑戰(zhàn)。解剖很難在供體之間進(jìn)行區(qū)分和復(fù)制，這使研究無(wú)法將細(xì)胞類型明確地映射到其精確的解剖位置。作者也觀察到病理狀態(tài)，如缺血（例如星形膠質(zhì)細(xì)胞）（圖5），但如果沒(méi)有更廣泛的供體采樣，就無(wú)法證實(shí)這一觀察結(jié)果。作者的數(shù)據(jù)集無(wú)法得出關(guān)于供體特異性多樣性的結(jié)論；細(xì)胞類型如何隨年齡、性別、行為和疾病狀態(tài)而變化，將是未來(lái)令人興奮的研究方向。

然而，本研究設(shè)計(jì)能夠?qū)φ麄€(gè)大腦的區(qū)域差異進(jìn)行重要觀察。研究認(rèn)為目前對(duì)端腦外神經(jīng)元多樣性的理解存在顯著差距，反映了這些區(qū)域的解剖學(xué)復(fù)雜性。Splatter神經(jīng)元以出乎意料的復(fù)雜模式表達(dá)神經(jīng)肽、神經(jīng)遞質(zhì)和其他神經(jīng)元基因。例如，TH+、多巴胺能和5-羥色胺能神經(jīng)元表達(dá)不同的神經(jīng)肽和梯度范圍的GABA能標(biāo)記物，產(chǎn)生顯著的分子多樣性。這一結(jié)果表明，未來(lái)的工作必須分析單個(gè)腦細(xì)胞核，以充分確定它們的細(xì)胞多樣性。