威斯康辛大學(xué)麥迪迅分校張素春教授、南京大學(xué)陶云龍博士等在 Nature Biotechnology 期刊發(fā)表了題為：Generation of Locus Coeruleus Norepinephrine Neurons from Human Pluripotent Stem Cells 的研究論文。

該研究揭示了人類藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵信號(hào)通路，并在此發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了其體外的高效分化。

該研究成果為去甲腎上腺素能神經(jīng)元的相關(guān)研究提供了良好的模型，使我們有機(jī)會(huì)進(jìn)一步理解它在相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用，也讓開發(fā)藥物治療相關(guān)疾病成為可能。

藍(lán)斑核（Locus coeruleus，LC），簡(jiǎn)稱藍(lán)斑，是位于后腦第四腦室底，腦橋前背部，主要由去甲腎上腺素能神經(jīng)元（Norepinephrine neuron，NE）組成的神經(jīng)核團(tuán)。它是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中合成去甲腎上腺素的主要部位，參與許多重要的生理功能如覺醒，清醒，應(yīng)激反應(yīng)，注意力集中，記憶及應(yīng)激反應(yīng)等。藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元，與中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元類似，因含有神經(jīng)黑色素（neuromelanin）從而使其呈現(xiàn)出肉眼可辯的顏色。

藍(lán)斑雖在大腦中具有十分重要功能，但其所含的神經(jīng)元數(shù)量卻非常少。如非人類靈長(zhǎng)類的藍(lán)斑僅含有10000-30000個(gè)去甲腎上腺素能神經(jīng)元；在人類大腦中，這一數(shù)量為20000-50000。雖數(shù)量較少，藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元卻可以通過(guò)大量的神經(jīng)元軸突分支投射到幾乎整個(gè)大腦中，參與眾多腦區(qū)的功能調(diào)節(jié)。

藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元的功能異常與眾多神經(jīng)系統(tǒng)疾病有著密切的關(guān)聯(lián)。例如，在患有神經(jīng)退行性疾病如老年癡呆癥及帕金森病的病人中，藍(lán)斑是出現(xiàn)神經(jīng)元退行性死亡的最早核團(tuán)之一；另外，藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元病變還與焦慮、抑郁、Rett綜合癥等神經(jīng)疾病有關(guān)。

然而，目前我們對(duì)于藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元在這些神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的具體功能依然知之甚少，其中一個(gè)最重要的原因是缺乏合適的細(xì)胞模型，可以讓我們?cè)隗w外模擬人類的去甲腎上腺素能神經(jīng)元。通過(guò)從人多能干細(xì)胞（Pluripotent stem cell，PSC）分化得到真正、可靠的去甲腎上腺素能神經(jīng)元理論上可以有效地解決這一困境。但由于前期對(duì)人類藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元發(fā)育過(guò)程的研究較少，我們對(duì)其發(fā)育過(guò)程中的命運(yùn)調(diào)控機(jī)制還不甚了解，導(dǎo)致其體外分化的系統(tǒng)至今尚未實(shí)現(xiàn)，嚴(yán)重制約了相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

早期的動(dòng)物研究表明，藍(lán)斑發(fā)育起源于第一個(gè)菱腦原節(jié)（Rhombomere 1，R1）的背側(cè)。該區(qū)域的神經(jīng)上皮細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中可進(jìn)一步分化成一系列腦組組包括小腦，藍(lán)斑等。研究人員假定人類的藍(lán)斑組織和其他脊椎動(dòng)物一樣具有相似的發(fā)育途徑。因此為了相應(yīng)地得到人類的藍(lán)斑組織細(xì)胞，研究人員首先需要將人多能干細(xì)胞分化成具有第一個(gè)菱腦原節(jié)身份的神經(jīng)上皮細(xì)胞。已有的研究表明WNT信號(hào)通路的活性可以調(diào)控神經(jīng)管從前端（前腦）至后端（后腦及脊髓）的區(qū)域化，通過(guò)調(diào)控WNT信號(hào)通路的活性可以有效、精準(zhǔn)地將多能干細(xì)胞分化成具有特定區(qū)域身份神經(jīng)上皮細(xì)胞。研究人員首先基于此策略成功得到了R1區(qū)域的神經(jīng)上皮細(xì)胞，然而，當(dāng)研究人員進(jìn)一步檢測(cè)與去甲腎上腺素能神經(jīng)元發(fā)育有關(guān)的標(biāo)記蛋白（ASCL1、PHOX2B）時(shí)，卻發(fā)現(xiàn)非常少的細(xì)胞表達(dá)此類蛋白，也即表明R1神經(jīng)上皮細(xì)胞中含有的去甲腎上腺素能神經(jīng)祖細(xì)胞非常少，去甲腎上腺素能神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育需要額外的信號(hào)才能完成由R1細(xì)胞到其祖細(xì)胞的特化（specification）。

為了找到影響人類去甲腎上腺素能神經(jīng)元發(fā)育的關(guān)鍵信號(hào)，研究人員大量篩選了那些在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)去甲腎上腺素能神經(jīng)元發(fā)育過(guò)程中起重要作用的信號(hào)通路如BMP、FGF等，但卻沒有發(fā)現(xiàn)它們對(duì)人類去甲腎上腺素能神經(jīng)元有任何正面作用，其中BMP信號(hào)通路反而明顯地抑制了去甲腎上腺素能神經(jīng)祖細(xì)胞的產(chǎn)生。

幸運(yùn)的是，在大量篩選之后研究人員意外地發(fā)現(xiàn)ACTIVIN A可以有效地誘導(dǎo)去甲腎上腺素能神經(jīng)組細(xì)胞的產(chǎn)生。正是基于這一全新的發(fā)現(xiàn)，研究人員終于找到了可以正向?qū)1神經(jīng)上皮細(xì)胞特化成去甲腎上腺素能神經(jīng)祖細(xì)胞的方法。進(jìn)一步的研究表明ACTIVIN A 對(duì)于去甲腎上腺素能神經(jīng)祖細(xì)胞的誘導(dǎo)作用具有區(qū)域特異性，即只有R1區(qū)域的神經(jīng)上皮細(xì)胞才對(duì)ACTIVIN A 的處理有反應(yīng)，而其他區(qū)域的神經(jīng)上皮細(xì)胞是不能產(chǎn)生去甲腎上腺素能神經(jīng)祖細(xì)胞，這一特性與藍(lán)斑細(xì)胞的起源高度一致。除此之外，ACTIVIN A 對(duì)去甲腎上腺素能神經(jīng)祖細(xì)胞的誘導(dǎo)也具有劑量及時(shí)間依賴性。

通過(guò)ACTIVIN A信號(hào)通路可以調(diào)控去甲腎上腺素能神經(jīng)元發(fā)育這一發(fā)現(xiàn)，研究人員最終實(shí)現(xiàn)了去甲腎上腺素能神經(jīng)元的體外高效分化。分化得到的去甲腎上腺素能神經(jīng)元具有與體內(nèi)去甲腎上腺素能神經(jīng)元相似的特征如生產(chǎn)、釋放和回收去甲腎上腺素神經(jīng)遞質(zhì)，大量的軸突分支，CO₂感應(yīng)等。這一系列去甲腎上腺素能神經(jīng)元特有的特征進(jìn)一步表明多能干細(xì)胞分化的細(xì)胞是有功能的去甲腎上腺素能神經(jīng)元。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證多能干細(xì)胞分化的去甲腎上腺素神經(jīng)細(xì)胞，研究人員開展了多時(shí)間點(diǎn)的單細(xì)胞測(cè)序?qū)嶒?yàn)，動(dòng)態(tài)地分析了處于分化中的細(xì)胞組成及其分化途徑，證實(shí)了去甲腎上腺素神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)分子標(biāo)記物及其比例。另外與體內(nèi)組織的單細(xì)胞數(shù)據(jù)比較，研究人員發(fā)現(xiàn)，去甲腎上腺素神經(jīng)細(xì)胞的基因表達(dá)與胚胎期小鼠藍(lán)斑區(qū)域的細(xì)胞高度相似，進(jìn)一步驗(yàn)證了該細(xì)胞類型。

圖1：由人多能干細(xì)胞分化得到去甲腎上腺素神經(jīng)元具有多種該神經(jīng)元所特有的特征

為了展示多能干細(xì)胞分化得到的去甲腎上腺素能神經(jīng)元的應(yīng)用，研究人員通過(guò)基因編輯技術(shù)將可以感應(yīng)去甲腎上腺素神經(jīng)遞質(zhì)的基因（NE sensor）插入到人多能干細(xì)胞的基因組中，再通過(guò)去甲腎上腺素能神經(jīng)元體外的分化方法得到可以同時(shí)生產(chǎn)、釋放、回收以及檢測(cè)去甲腎上腺素的神經(jīng)元。這一細(xì)胞平臺(tái)可以用于篩選藥物來(lái)治療那些由于去甲腎上腺素神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)生紊亂而導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)疾病（抑郁等）。為了驗(yàn)證這一設(shè)想，研究人員使用目前在市場(chǎng)用于治療抑郁的藥物進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)靶向去甲腎上腺素神經(jīng)遞質(zhì)的重回收過(guò)程的藥物可以顯著提高NE sensor的信號(hào)強(qiáng)度，而那些靶向多巴胺或血清素神經(jīng)遞質(zhì)的藥物卻對(duì)NE senor沒有明顯影響。這些結(jié)果表明該藥物篩選平臺(tái)可以用于高通量地尋找靶向調(diào)控去甲腎上腺素神經(jīng)遞質(zhì)的新型藥物。

圖2：利用人多能干細(xì)胞分化的去甲腎上腺素能神經(jīng)元開發(fā)藥物篩選平臺(tái)

南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院及化學(xué)和生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院雙聘博士生導(dǎo)師陶云龍研究員為論文第一作者兼共同通訊作者，威斯康辛大學(xué)麥迪迅分校張素春教授為論文的共同通訊作者。