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一、實驗介紹 腦電圖 (Electroencephalogram，EEG) /肌電圖 (Eectromyography，EMG) 是目前睡眠領(lǐng)域所接受的用來評估睡眠行為的最重要標(biāo)準(zhǔn)。德國精神科醫(yī)生HansBerger在1929年發(fā)現(xiàn)，在人頭皮記錄的電勢呈現(xiàn)正弦波的形式，其頻率與測試人員的清醒水平直接相關(guān)，從而在睡眠覺醒的理解方面取得了迅速的進步。直到今天，腦電圖與肌電圖結(jié)合使用幾乎囊括了所有的實驗性和臨床評估數(shù)據(jù)，將行為和生理學(xué)與包括人類在內(nèi)的行為動物中的皮質(zhì)神經(jīng)元的活性相關(guān)聯(lián)。其中，通過對獲得的電信號數(shù)據(jù)進行模式和頻譜分析（傅里葉變換），可以將睡眠分為非快動眼睡眠（NREM）和快動眼睡眠（REM）。 NREM睡眠的特征是快速而低振幅的腦電圖隨機眼運動和肌肉松馳。REM睡眠也被稱為矛盾的睡眠，因為在這個階段，大腦活動類似于覺醒狀態(tài)，而大腦此時在很大程度上與外界斷開了，并且似乎處于深度睡眠狀態(tài)。對這一現(xiàn)象，很多研究推測之前覺醒階段的記憶所產(chǎn)生的突出增強，會在REM睡眠階段得到重復(fù)刺激，以此來避免睡眠過程中突觸凈縮減所造成的記憶的遺忘。相比之下，NREM睡眠期間雖然存在運動神經(jīng)元的激活，但沒有眼睛運動。人類NREM睡眠可以分為4個階段，其中第4階段被稱為深度睡眠或慢波睡眠(Slow-wave sleep)，并通過腦電圖在0.5-4 Hz之間的 δ 活動慢波來鑒定。大鼠和小鼠的NREM睡眠目前并沒有詳細的劃分，這主要是因為它們沒有長期的，類似于人類的固定睡眠時間。 對于睡眠的持續(xù)時間（數(shù)量）或睡眠強度（質(zhì)量）的分析評判，則主要是根據(jù)腦電圖 (EEG) / 肌電圖 (EMG) 來進行。覺醒時長、NREM睡眠時長、REM睡眠時長、不同睡眠覺醒階段的轉(zhuǎn)換持續(xù)時長和頻率更多的用來評價睡眠的數(shù)量需求和睡眠的穩(wěn)定性。NREM睡眠開始及REM睡眠開始的延遲時長、睡眠后短暫覺醒和NREM睡眠階段的 δ 活動更多的來評價睡眠的質(zhì)量。 二、實驗工具 紅霉素軟膏、聚維酮碘（碘伏）、3% 過氧化氫、生理鹽水、林可霉素利多卡因凝膠、齒科樹脂黏接劑。 螺絲刀、精細鑷子、剪刀、縫合針線、氣體麻醉劑，體視解剖顯微鏡和立體定位儀，EEG / EMG 底座、顱釘、EEG / EMG 記錄系統(tǒng)和Sirenia? Sleep pro睡眠分析軟件。 三、實驗方法 EEG / EMG電極植入方法： 1.腹腔注射 (i.p.) 7% 水合氯醛麻醉小鼠。 2.在確認小鼠缺乏后腳掌按壓疼痛之后，頭頸部剪毛后碘伏消毒，再用乙醇清潔消毒。 3.將小鼠固定在立體定位注射儀上，并通過調(diào)節(jié)旋鈕，使得小鼠腦袋基本平行。在小鼠眼睛上涂抹紅霉素軟膏，防止長時間照射影響小鼠視力。 4.使用眼科剪刀沿中線剪開頭頂皮膚，將小鼠顱骨暴露出來，并將裸露的頭骨用棉球蘸取3% 過氧化氫擦拭去除骨膜并清潔顱骨骨面，以方便頭骨和牙科水泥的結(jié)合固定。 5.根據(jù)小鼠頭骨的縫隙找到Bregma點，Lambda點，調(diào)平頭骨。 6.用立體定位將電鉆將其移至Lambda點，并將坐標(biāo)設(shè)置為(0，0，0)，然后通過顱骨中的電鉆鉆四個孔?？椎淖鴺?biāo)如下： (-1.27，0，0)，(-1.27，503，0)，(1.27，5.03，0) 和 (1.27，0，0)。 7.將EEG電極引腳植入顱下的硬腦膜，并將EMG電線插入頸部肌肉中，然后用牙科水泥將記錄電極粘在頭骨上。 8.麻醉恢復(fù)期間，將動物置于電熱毯上，密切觀察呼吸，若呼吸道分泌物過多可用吸痰管清理，直至麻醉蘇醒，手術(shù)在無菌條件實施。術(shù)后連續(xù)注射3天青霉素，恢復(fù)一周開始適應(yīng)睡眠記錄系統(tǒng)。動物后恢復(fù)期間應(yīng)定期撫摸動物減少應(yīng)激反應(yīng)。 EEG / EMG 數(shù)據(jù)采集方法： 1.小鼠術(shù)后恢復(fù)一周，期間密切觀察小鼠傷口情況，若有滲出物應(yīng)及時予碘消毒處理?；謴?fù)后的小鼠置于隔音、恒濕、恒溫、通風(fēng)良好、12h/12h自動明周期的睡眠記錄室中。 2.將小鼠連至記錄系統(tǒng)，適應(yīng)2天，之后開始睡眠覺醒記錄，按照實驗需求進行一段時間的EEG / EMG信號記錄。 3.基礎(chǔ)睡眠記錄結(jié)束后，可以人為對小鼠進行睡眠剝奪，藥物注射等防止小鼠睡眠，再通過治療給藥研究待測藥物對睡眠障礙模型小鼠的作用特點。 4.使用SleepyScore軟件，將睡眠/喚醒狀態(tài)分為20s NREM睡眠 (高振幅，1-4Hz的delta頻率EEG和EMG信號緊張)，REM睡眠 (高振幅，6-9Hz的Theta頻率EEG和EMG信號松弛)或者覺醒 (低振幅，快速的EEG和高振幅，可變的EMG信號)。然后合并計算，輸出為每個小時的NREM睡眠，REM睡眠和覺醒時間及DeltaPower等。 四、測試指標(biāo)的行為學(xué)意義 以10s為段解析睡眠覺醒時相，以1s為單位解析 EEG功率譜 (0-3Hz)。小鼠睡眠覺時相包括覺醒 ( wakefulness，W) ，NREM和REM睡眠。 W 時相的EEG特征為低幅快波 (主要為14.5-60Hz的gamma和beta波)，伴顯著肌電活動，以額-頂葉引導(dǎo)出低幅快波腦電和明顯的肌電活動為特征； NREM 睡眠以睡眠梭形波和高幅慢波為特征，肌電活動明顯減少，EEG主要為0.5-4Hz的delta波，有時夾雜9-14Hz的alpha波； REM 睡眠以低幅快波為特征，除偶爾有肌肉抽動外，無明顯肌電活動，EEG以4.5-8.5Hz的theta波為主，EMG活動消失。 五、數(shù)據(jù)統(tǒng)計 使用睡眠分析軟件 Sirenia?Sleep pro 對 EEG 和 EMG 信號進行分析，使用GraphPad Prism進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計。 六、注意事項 ①盡量選擇戊巴比妥鈉等藥效穩(wěn)定的麻醉藥麻醉小鼠。水合氯醛不能減輕小鼠疼痛，違反動物倫理學(xué)；異氟烷氣麻易引起小鼠呼吸急促甚至死亡，增加手術(shù)失敗率。 ②立體定位過程，中耳桿需準(zhǔn)確插入小鼠耳洞中，深度一般為左右各6mm， 太深易致死；顱骨表面盡量調(diào)平，否則會影響 EEG / EMG 底座的放置，進而影響信號的采集。 ③為保證EEG 記錄準(zhǔn)確性，植入的底座前邊緣位置應(yīng)在前囟前側(cè) 3.0～3.5 mm 處，該條件下所有螺釘會更牢固地固定在小鼠顱骨上。 ④使用新的 8245-23 型注射針對顱骨打孔，動作輕柔地將針刺入顱骨，切忌打孔過深導(dǎo)致大出血或影響顱釘?shù)穆裰病?/span> ⑤顱釘植入一半時需將導(dǎo)電膠滴在螺紋處，擰緊顱釘。為防止底座脫落，牙科水泥需緊密包裹住底座且不要接觸小鼠皮膚。 ⑥用精細鑷將 EMG 肌電絲置入頸部肌肉中并縫合。不可植過淺導(dǎo)致肌電絲中途滑出。 七、心得經(jīng)驗 小鼠 EEG / EMG 信號采集技術(shù)既有優(yōu)點也有其不足。 一方面，因為EEG是對大腦神經(jīng)活動進行直接和實時測量，所以它可能要求特定的神經(jīng)生理通路、意識/睡眠狀態(tài)以及大腦功能的精確時間動態(tài)(dys)的完整性。此外，當(dāng)這種精細的時間分辨率與估計潛在來源相結(jié)合時，就可以描述大腦網(wǎng)絡(luò)、它們的連通性，以及特定活動在給定函數(shù)的過程中被認為是串行還是并行的程度。 另一方面，由于EEG是對電位進行測量，這對通過使用EEG來充分分析和解釋活躍點與參考點的測量結(jié)果十分重要。然而，由于產(chǎn)生腦電圖的神經(jīng)活動在整個大腦中傳導(dǎo)，這意味著人們不能假定記錄在頭皮上某一點的信號的源頭就在正下方，無法精確到研究某一個腦區(qū)的電活動對睡眠的影響。 目前小鼠皮層腦電多導(dǎo)睡眠監(jiān)測系統(tǒng)發(fā)展迅速，不僅有傳統(tǒng)的有線腦電監(jiān)測，無線記錄系統(tǒng)也逐漸得到廣泛應(yīng)用。無線EEG / EMG系統(tǒng)利用輕巧的無線穩(wěn)壓器裝置，在動物頭部即可完成腦電圖和肌電信號的數(shù)字化處理，并通過藍牙技術(shù)傳輸至電腦采集軟件進行處理分析。消除了傳統(tǒng)有線式設(shè)備對于動物活動的限制，使動物更加接近于自由活動的生理狀態(tài)，因而采集的數(shù)據(jù)精確度更高。相對于傳統(tǒng)腦電圖遙測設(shè)備，無線 EEG / EMG系統(tǒng)具有信號接收范圍廣且干擾小等特點。 |
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