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近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測序已經(jīng)成為研究基因表達(dá)調(diào)控的主要手段。我們知道，很多物種的轉(zhuǎn)錄本非常多樣和復(fù)雜，絕大多數(shù)真核生物基因不符合“一基因一轉(zhuǎn)錄本”的模式，這些基因往往存在多種剪切形式。通過二代測序，可以很準(zhǔn)確地進(jìn)行基因的表達(dá)及定量的研究，但是由于讀長的限制，不能得到全長轉(zhuǎn)錄本的信息。因此，基于三代測序平臺(tái)的全長轉(zhuǎn)錄組成為新的研究熱潮。 全長轉(zhuǎn)錄組（Full-length transcriptome）是基于PacBio和Nanopore三代測序平臺(tái)，無需打斷拼接，直接獲得包含5’UTR、3’UTR、polyA尾的mRNA全長序列及完整結(jié)構(gòu)信息，從而準(zhǔn)確分析有參考基因組物種可變剪接及融合基因等結(jié)構(gòu)信息，克服無參考基因組物種轉(zhuǎn)錄本拼接較短、信息不完整的難題。同時(shí)還可以借助二代測序數(shù)據(jù)，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本特異性表達(dá)分析，獲得更加全面的注釋信息。
圖1 大鼠中已證實(shí)的全長轉(zhuǎn)錄本 圖2 全長轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)流程 全長轉(zhuǎn)錄組采用單分子實(shí)時(shí)測序技術(shù)，通過構(gòu)建啞鈴型文庫，以環(huán)形方式循環(huán)測序。測序時(shí)，短片段文庫更容易落入零模波導(dǎo)孔（ZMWs）。 
Polymerase read: 三代測序直接讀取的序列，包含接頭和插入片段； Subreads: 將Polymerase read接頭去除，插入片段每測一次，生成一條subread； CCS read: 來源于同一條Polymerase read的subreads (至少兩條)生成的一致性序列。
全長轉(zhuǎn)錄項(xiàng)目設(shè)計(jì) 針對(duì)有參考基因組的物種，全長轉(zhuǎn)錄組信息可以糾正基因組的錯(cuò)誤組裝、更準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本和基因、分析基因融合事件等。 針對(duì)參考基因組不完善的物種，全長轉(zhuǎn)錄組可優(yōu)化基因結(jié)構(gòu)，輔助基因組組裝和注釋，提高基因表達(dá)量準(zhǔn)確性和數(shù)據(jù)利用率。針對(duì)無參考基因組的物種，通過三代全長轉(zhuǎn)錄組測序來構(gòu)建物種Unigene庫，無需進(jìn)行序列組裝，就可以獲得該物種轉(zhuǎn)錄組水平的參考序列（轉(zhuǎn)錄組水平的參考基因組），為后續(xù)研究提供很好的遺傳信息基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)錄組具有時(shí)空特異性，根據(jù)研究目的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，如下：
圖4 全長轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 建議2+3代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)同時(shí)使用，保證結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確性、序列完整性及序列表達(dá)量準(zhǔn)確性，達(dá)到數(shù)據(jù)的最優(yōu)利用效果以及性價(jià)比最高。針對(duì)不同要求及目的，對(duì)于大部分物種來說推薦測序數(shù)據(jù)量8-12G，研究低表達(dá)基因、可變剪切事件、多倍體或者基因數(shù)目較多的物種，需適量增加數(shù)據(jù)量。獲得原始測序序列（Sequenced Reads）后，通過如下流程進(jìn)行生物信息分析：
圖5 凌恩生物全長轉(zhuǎn)錄組生物信息分析流程 凌恩生物全長轉(zhuǎn)錄組測序優(yōu)勢 - 無需進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本拼接，能夠直接獲得全長轉(zhuǎn)錄本序列，從而更真實(shí)的反映測序物種的轉(zhuǎn)錄組信息；
能夠檢測多種可變剪切形式，發(fā)現(xiàn)更多的剪接位點(diǎn)和可變剪切事件； 能夠發(fā)現(xiàn)新的功能基因，補(bǔ)充基因組注釋； 有助于融合基因、同源基因、超家族基因或等位基因的精確分析； 專業(yè)的生信分析團(tuán)隊(duì)，項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)豐富。
一般總RNA>5 ug/文庫，總量>15 ug（3個(gè)文庫），濃度≧250ng/ul。 OD260/280≧1.8，OD260/230≧1.0，260nm處有正常峰值；總RNA的RIN值≧8.0，28S/18S≧1.3。 采用安全染料，避免EB和紫外照射對(duì)cDNA造成損傷。 總之，三代全長轉(zhuǎn)錄組對(duì)于有參物種和無參物種均適用，獲得更多的轉(zhuǎn)錄調(diào)控事件，從而更真實(shí)的反映測序物種的轉(zhuǎn)錄組信息。目前，全長轉(zhuǎn)錄組測序研究基因結(jié)構(gòu)已經(jīng)成為發(fā)文章的趨勢，研究物種包括高粱、玉米、擬南芥、雞、人和小鼠、毛竹、棉花等。凌恩生物提供專業(yè)的全長轉(zhuǎn)錄組測序及分析服務(wù)，助力您的研究！
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