厚積薄發(fā)  

類器官技術(shù)建立在干細胞技術(shù)以及經(jīng)典發(fā)育生物學(xué)和細胞混合實驗的基礎(chǔ)之上；類器官的出現(xiàn)無疑是對干細胞研究不懈探索的驚喜回饋。

腸上皮是成年哺乳動物中自我更新最快的組織，自 2007 年，Hans Clevers 實驗室就通過譜系追蹤 (lineage tracing) 發(fā)現(xiàn)腸道 Wnt 靶基因中隱窩基底循環(huán)柱狀細胞表達的 Lgr5 (leucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled receptor 5, Gpr49) 可作為腸和結(jié)腸的干細胞的成體干細胞標(biāo)志物，這也就是大名鼎鼎的 Lgr5⁺ 細胞。

2009 年，Hans Clevers 和 Toshiro Sato 用來源于小鼠腸道的成體干細胞培育出一個微型腸道 (Mini-guts) 類器官，開啟了類器官技術(shù)的發(fā)展的“新紀(jì)元”。

圖 1. 類器官培養(yǎng)發(fā)展時間軸^[2]

 腸道類器官技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多種領(lǐng)域，包括疾病建模、藥物開發(fā)和篩選、宿主-微生物相互作用、腸道生物學(xué)與發(fā)育等。
也有研究描述了將基因組編輯技術(shù)，如 CRISPR/Cas9 與類器官培養(yǎng)系統(tǒng)結(jié)合，使類器官易于基因操縱，并將其轉(zhuǎn)化為一個多功能的培養(yǎng)系統(tǒng)。因此，腸類器官培養(yǎng)系統(tǒng)開啟了小腸上皮體外建模的新時代，在個性化和再生醫(yī)學(xué)中具有廣闊的應(yīng)用前景。  

腸道類器官的 “養(yǎng)成記”  

3D 腸類器官由一個封閉的循環(huán)中空腔組成，內(nèi)襯一層腸上皮細胞系。腸上皮的分化細胞系，包括腸上皮細胞，腸內(nèi)分泌細胞和杯狀 (Paneth) 細胞，排列在絨毛狀區(qū)內(nèi)。 

腸類器官的發(fā)育類器官可來源于器官限制成體干細胞 (ASCs) 和多能干細胞 (PSCs) 兩種干細胞。這兩種干細胞來源產(chǎn)生的類器官包含體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的所有腸上皮細胞類型，比例和排列相似。

圖 2. 體外培養(yǎng) ASC 來源的腸類器官^[3] 

培養(yǎng)類器官的主要成分是細胞外基質(zhì)和培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加促腸道發(fā)育的生長因子。其中，細胞外基質(zhì) (ECM) 為干細胞的粘附、生長和分化提供了必需的結(jié)構(gòu)支持和生化誘因。類器官的形成和生長在很大程度上依賴于培養(yǎng)基成分，這些成分構(gòu)成了十分接近體內(nèi)干細胞生態(tài)位 (Niche) 的信號通路，以維持干細胞的功能，促進其擴展和分化為器官的特定細胞類型。 如果把腸道類器官培養(yǎng)當(dāng)成是養(yǎng)成游戲，那么該怎么喂養(yǎng)呢，“定食” 還是“DIY 自助餐”？

圖 3. 體外培養(yǎng) PSC 來源的腸類器官^[3]

■ 基礎(chǔ)套餐來一套：

腸道類器官培養(yǎng)基的關(guān)鍵成分包括 Wnt-3a (W)、表皮生長因子 (EGF) (E)、Noggin (N) 和 R-spondin-1 (R)，統(tǒng)稱為 WENR 培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中有序地添加這些生長因子可調(diào)控干細胞生態(tài)位信號通路 (包括 Wnt、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (BMP) 和 Notch 信號通路)，誘導(dǎo)腸道干細胞 (ISCs) 自我更新、增殖和分化。

■ “自助”更有它的妙：

也有一些研究表明，向 ENR 培養(yǎng)基 (包含 EGF + Noggin + R-spondin-1) 中加入其它成分，以誘導(dǎo)干細胞走向特定的分化命運。

例如，引入兩種小分子的組合，如 CHIR99021 + Valproic acid 或者是 LDN-193189 + CHIR99021，可協(xié)同促進 Lgr5⁺ ISCs 在自我更新和未分化狀態(tài)下的維持，得到富含 ISCs 的培養(yǎng)。

通過補充 DAPT + CHIR99021、Valproic acid + IWP-2 或 DAPT + IWP-2 的 ENR 培養(yǎng)基培養(yǎng)可獲得分化表型，這些分子相互配合誘導(dǎo) ISCs 直接分化為 Paneth 細胞 (杯狀細胞) 及腸細胞和分泌細胞譜系 (腸內(nèi)分泌細胞)。也有人認為，DAPT 或 BMP 分子的加入足以促進 ISC 分化并產(chǎn)生多譜系腸類器官。

雖然關(guān)于類器官培養(yǎng)基的組成有詳細的綜述，但不同方案的成分有時會存在差異，在培養(yǎng)技術(shù)中需要大量的試驗和摸索，以確定劑量和時機，達到預(yù)期結(jié)果。

 有說有練真把式 ，培養(yǎng)基 DIY！  

2020 年 3 月，類器官“鼻祖” Hans Clevers 的團隊再在 Science 上發(fā)表大作：SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes，揭示了新型冠狀病毒對人類腸道的有效感染。他們靈活運用腸道類器官的培養(yǎng)條件，將病毒對人類腸道的感染可視化。

hSIO (human small intestinal organoids; 人類小腸類器官) 由原代腸道上皮干細胞建立，通過符合倫理規(guī)范途徑獲得人類腸道組織樣本。他們設(shè)定了四種不同培養(yǎng)（EXP、DIF、DIF-BMP、EEC）條件：

EXP：在 Wnt EXP (Expansion medium) 中生長的 hSIO 絕大多數(shù)由干細胞和腸細胞祖細胞組成，與 Wnt 條件培養(yǎng)基不同，培養(yǎng)基中添加 Wnt 替代物 (U-Protein Express)。

DIF：在 ENR 中實現(xiàn)了一般分化，稱為 DIF (differentiation medium)，在 DIF 培養(yǎng)基中生長的類器官含有腸細胞、杯狀細胞和少量腸內(nèi)分泌細胞 (EEC)。

DIF+BMP：通過從 ENR 中除去 Noggin 并添加 BMP-2/BMP-4 激活 BMP，導(dǎo)致進一步成熟。

EEC: 在 DIF + BMP 的條件下，用強力霉素 (Doxycycline) 在 ENR 培養(yǎng)基中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的載體中誘導(dǎo) NeuroG3 的表達，以誘導(dǎo) EEC 數(shù)量增加。

如圖 3 所示，四種培養(yǎng)條件下生長的 hSIO 暴露于 SARS-CoV  和 SARS-CoV-2 2 種病毒。在所有培養(yǎng)條件下，兩種病毒的傳染性病毒顆粒和病毒 RNA 的滴度均顯著增加。

圖 4：SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 在 hSIO 中復(fù)制^[12]

SARS-CoV（藍）SARS-CoV-2（紅）感染后 24、48 和 60 小時，測定裂解的類器官活病毒滴度。

為了確定病毒目標(biāo)細胞類型，對 hSIO 進行了共聚焦分析，不同的培養(yǎng)條件下共聚焦分析顯示，SARS-CoV-2 的目標(biāo)細胞為增殖的腸上皮細胞祖細胞 (EXP 條件下) 或有絲分裂后的腸細胞 (DIF 條件下)，而腸內(nèi)分泌細胞幾乎沒有感染。

圖 5. SARS-CoV-2 感染 hSIO 的共聚焦分析^[12]

類器官腸上皮細胞刷狀緣肌動蛋白通過 Phalloidin 標(biāo)記 (綠色)，DAPI 標(biāo)記細胞核 (藍色)，病毒 dsRNA 染色顯示感染細胞。A. 增殖的細胞在擴張的類器官中體現(xiàn)，Ki67 標(biāo)記增殖細胞 (紅色)；B. 腸上皮細胞在分化的類器官中體現(xiàn)，APOA1 標(biāo)記有絲分裂后的腸細胞 (紅色)

看到這里，不得不稱贊一句 Hans Clevers 類器官培養(yǎng)玩兒得真溜！絕絕子！

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參考文獻

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10. Madeline A Lancaster, Juergen A Knoblich. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 2014 Jul 18;345(6194):1247125.

11. Mo Li, Juan C Izpisua Belmonte. Organoids - Preclinical Models of Human Disease. N Engl J Med. 2019 Feb 7;380(6):569-579.

12. Mart M Lamers, Hans Clevers, et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science . 2020 Jul 3;369(6499):50-54.