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免疫熒光結(jié)果不理想，可能是固定劑和通透劑的鍋！

 菌心說 2023-02-16 發(fā)布于北京
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在所有抗體相關(guān)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，如果說免疫印跡（WB）是最樸素?zé)o華的，那免疫熒光（IF）一定是最絢爛奪目的那個(gè)！
IF數(shù)據(jù)一拿出來，老板都舍不得在組會上批評你！
“道理我們都懂，IF實(shí)驗(yàn)也做完了?？墒?，為什么我的蛋白定位和別人做的不一致呢？這數(shù)據(jù)我也不敢給老板匯報(bào)啊~555~”有小伙伴向小編哭訴。
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FEN1抗體（貨號：14768-1-AP）染NIH/3T3細(xì)胞
FEN1是一種結(jié)構(gòu)特異性核酸酶，理論上應(yīng)在細(xì)胞核表達(dá)，前人研究中免疫熒光結(jié)果與預(yù)期一致，細(xì)胞核染色（左圖）。
小伙伴使用相同的抗體anti-FEN1（貨號：14768-1-AP）染乙醇固定的NIH/3T3細(xì)胞 ，結(jié)果細(xì)胞質(zhì)著色，與預(yù)期及前人結(jié)果相悖（右圖）。
小伙伴表示有億點(diǎn)點(diǎn)委屈，為什么??？？?
......
不要慌，作為抗體應(yīng)用專家，免疫熒光小能手，小編這就給大伙兒梳理梳理，為什么會出現(xiàn)熒光信號不對的情況，究竟是誰的鍋？





1. 固定劑的鍋







做過細(xì)胞IF的同學(xué)都知道，在拿到樣本之后，我們很重要的一步就是要對細(xì)胞進(jìn)行固定。固定，顧名思義就是將細(xì)胞“固定”起來，這樣能長久的保持細(xì)胞形態(tài)和抗原狀態(tài)，讓抗原能夠與抗體更充分且更穩(wěn)定地結(jié)合。
可有多少同學(xué)知道，固定劑也會影響蛋白（抗原）的亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果？
比如，我們研究部分核蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)如果采用乙醇固定，就會出現(xiàn)胞漿染色的結(jié)果。
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B23/NPM1抗體（貨號：60096-1-Ig）染MCF-7細(xì)胞
左圖4%多聚甲醛固定MCF-7細(xì)胞（細(xì)胞核著色-陽性），右圖乙醇固定（細(xì)胞質(zhì)著色-非特異性著色）。
而當(dāng)我們用E-cadherin抗體染細(xì)胞膜時(shí)，如果采用的是4%多聚甲醛固定，也會出現(xiàn)細(xì)胞核假陽性信號。
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E-cadherin抗體（貨號：20874-1-AP）為細(xì)胞膜著色
左圖4%多聚甲醛固定MCF-7細(xì)胞（細(xì)胞核著色-非特異性著色），右圖乙醇固定（細(xì)胞膜著色-陽性）。
顯然，固定劑確實(shí)影響到蛋白（抗原）的亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果。不同固定劑的作用原理不同，不同靶蛋白及所用抗體特性不同，都可能影響到固定劑使用效果。因此選對合適的固定劑對一個(gè)準(zhǔn)確可靠的IF結(jié)果是至關(guān)重要的。
上面與預(yù)期結(jié)果不一致的小伙伴其實(shí)就是因?yàn)椴捎昧艘掖脊潭ú艑?dǎo)致了非特異性著色結(jié)果，前人的研究中均采用的4%多聚甲醛固定。
那么該如何挑選合適的固定劑呢？且往下看：
常用的固定劑種類很多，一般固定劑可分為兩大類：可溶性溶劑和交聯(lián)劑。可溶性溶劑比如丙酮、乙醇等能去除脂類物質(zhì)并使細(xì)胞脫水，把蛋白質(zhì)沉淀在細(xì)胞結(jié)構(gòu)上。交聯(lián)劑比如多聚甲醛可以通過自由氨基基團(tuán)把生物分子橋連起來，形成一個(gè)相互連接的抗原網(wǎng)。
組織或細(xì)胞經(jīng)過固定后可使胞內(nèi)蛋白凝固，減少或終止外源性酶和內(nèi)源性酶的反應(yīng)；保持組織或細(xì)胞的抗原性，避免抗原發(fā)生彌散；保持組織和細(xì)胞的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)。
不同類型固定劑優(yōu)缺點(diǎn)如下：
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根據(jù)多年抗體開發(fā)和蛋白檢測經(jīng)驗(yàn)，小編總結(jié)了一份【不同細(xì)胞器首選固定劑方法】，供大家參考：
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當(dāng)然，固定劑的選擇其實(shí)是沒有通用規(guī)則的，以上表格也是經(jīng)驗(yàn)之談，不排除有特殊情況。如果沒有達(dá)到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)效果，您也可以嘗試更換其他固定試劑。





2. 通透劑的鍋







說到固定劑，那就必須聊一下通透劑，通透劑沒選好同樣會造成IF結(jié)果不理想。
交聯(lián)固定劑比有機(jī)溶劑能更完整的保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，保存脂類物質(zhì)，但也會因此而阻礙抗體-抗原的結(jié)合，甚至屏蔽抗原表位，造成陰性檢測結(jié)果。因此可能需要增加一個(gè)通透步驟以使抗體能夠順利進(jìn)入并接觸抗原。我們可以根據(jù)靶標(biāo)所處的位置進(jìn)行選擇使用或者不使用通透劑，以及選擇何種強(qiáng)度的通透劑。
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 1）如果您檢測的是胞外表位（細(xì)胞膜表面蛋白、膜整合蛋白的胞外段等），則無需進(jìn)行通透，固定之后即可檢測。
2）如果您檢測的是胞內(nèi)表位（膜整合蛋白的胞內(nèi)段、細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞器膜外蛋白等），需選擇溫和的細(xì)胞通透劑，比如Digitonin、Leucoperm、Saponin和Tween 20等，它能夠在膜上打孔，增加細(xì)胞膜的通透性，使抗體進(jìn)入胞質(zhì)中，識別胞質(zhì)中的表位。
3）如果您檢測的是有膜細(xì)胞器內(nèi)的表位（核內(nèi)蛋白、線粒體內(nèi)的蛋白等），則需要采用強(qiáng)通透劑，比如Triton X-100和NP-40等，它們可以部分溶解細(xì)胞核膜等細(xì)胞器膜結(jié)構(gòu)，使抗體進(jìn)入細(xì)胞器內(nèi)部識別抗原并結(jié)合抗原表位。





3. 其他可能的鍋







總而言之呢，免疫熒光結(jié)果不理想，可能的原因非常多，其中固定劑和通透劑的選擇也至關(guān)重要的一步，希望大家要牢記！
除此之外的可能原因，小編這里根據(jù)多年的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)了一份【免疫熒光疑難解析】，針對各種不理想情況分析了“鍋”的歸屬，希望對大家有所幫助！
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