北大最新《Nature》：揭示肝癌新療法！

intelUNION 2023-01-23 發(fā)布于河南

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肝癌是死亡率僅次于胃癌、食道癌的第三大常見惡性腫瘤，我們國家屬于全球肝癌發(fā)生率相對較高的區(qū)域（占全球發(fā)生率~47%）。在每10萬中國人中，會有8~10個以上患有肝癌。尤其是某些高危人群出現(xiàn)乙肝丙肝患者或者是高危人群發(fā)生，是每10萬人有500多人。原發(fā)性肝癌（PLC）有三種主要的組織學亞型：肝細胞癌（HCC）、肝內膽管癌（ICC）和肝細胞和肝內膽管聯(lián)合癌（CHC）。在現(xiàn)有的一些治療方案中，由各種免疫細胞和基質細胞組織的腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）的異質性是腫瘤轉移、復發(fā)和耐藥的主要因素，然而目前對于PLC的TIME分布了解十分有限，無法識別生物標志物以更好地進行患者分層，以至于無法深入理解不同的TIME亞型與肝癌的臨床相關性。

圖1 用于治療肝癌的肝臟切除及轉移手段

近日，來自北京大學第一醫(yī)院的張寧和北京大學生命科學學院的張澤民教授團隊通過對肝癌細胞異質性進行詳細分析，闡明了不同的TIME亞型，揭示了TAN的免疫抑制功能以及針對TAN的潛在免疫療法。研究將患者分為五種TIME亞型：免疫激活、骨髓或基質細胞介導的免疫抑制、免疫排斥和免疫滯留表型，并發(fā)現(xiàn)不同的TIME亞型在空間上存在有序組織，與趨化因子網絡和基因組特征相關。另外，研究也發(fā)現(xiàn)富含骨髓細胞介導免疫抑制亞型的腫瘤相關中性粒細胞（TAN）患者具備不良預后，并提出潛在針對TAN的療法。相關研究以“Liver tumour immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity”為題于2022年11月09日發(fā)表在國際頂級期刊《Nature》。

1. 大規(guī)模肝癌單細胞圖譜

為了含括所有細胞群的PLC的TIME分布，研究對124名未接受治療的患者的160個臨床樣本進行了scRNA-seq分析，其中包括79名HCC患者、25名ICC患者和7名CHC患者。最終共鑒定出89個TIME細胞簇，所鑒定的TIME細胞簇表現(xiàn)出與病因有關的組織性和癌癥類型偏好。與來自不同患者細胞的TIME簇相比，腫瘤細胞簇往往具有患者特異性?；诖碚鎸嵙餍胁W的PLC亞型組成，研究者們通過多方面數據，例如臨床信息、不同人群和匹配基因組圖譜的單細胞圖譜，成功對PLC的細胞異質性情況進行了大規(guī)模分析。

圖2 來自124例肝癌患者的樣本單細胞圖譜

2. 五種TIME亞型的揭示

為了研究PLC的TIME亞型，研究者對腫瘤組織中細胞的共富集模式進行了檢測分析，通過層級聚類確定了五個穩(wěn)定的細胞模塊（CM1–CM5）。進一步的，基于CM1–CM5的差異富集，研究提出了一種新型的分類方案“TIMELASER”，用于單細胞分辨率下的腫瘤免疫微環(huán)境亞型分類，并成功將研究中不同患者分為五個相應的TIME亞型，該分類的特性依據包括四個方面：（i）細胞簇，（ii）功能標記基因表達，（iii）TIME相關基因信號和（iv）預后相關性。通過索引（CODEX）分析代表性樣品和重新分析PLC33的空間轉錄組進行聯(lián)合檢測，研究者們成功地再現(xiàn)了每個亞型的細胞組成，從而進一步證實TIMELASER分類方案的可行性。通過外顯子組數據分析，研究發(fā)現(xiàn)TIMELASER亞型表現(xiàn)出不同的趨化因子網絡，并與腫瘤細胞的不同體細胞改變和轉錄組學特征相關。

圖3 PLC的五種TIME亞型

3. 肝癌中性粒細胞異質性

接下來，在TIME-ISM中多個中性粒細胞亞群的富集、及其與不良預后關聯(lián)的促使下，研究者們進一步對肝癌中性粒細胞進行了系統(tǒng)分析。通過mIHC，研究證實PLC含有中性粒細胞即表明ICC的中性粒細胞明顯多于HCC。最終整體結果展現(xiàn)了總共11個中性粒細胞亞群的異質性分層圖譜，并表面中性粒細胞分化可能是由轉錄因子以時空方式進行協(xié)調的。此外，為了系統(tǒng)地檢測TAN的功能，研究通過將人PBN與三種人肝癌細胞系HepG2、HCCLM3和MHCC97H以及對照細胞系HEK293T共培養(yǎng)來進行體外誘導TAN，結果表明PBN和ALN亞群的信號下調，而大多數TAN亞群被上調，其中Neu_11_CCL4的信號最高，與scRNA-seq數據相符。此外，通過對Neu_11_CCL4和Neu_09_IFIT1兩個TAN亞群的表型和功能進行重點研究，研究者們發(fā)現(xiàn)與IFNγ⁺細胞的相互作用可能有助于Neu_09_IFIT1的高PD-L1表達。為深入研究TAN在體內的異質性功能，研究構建了兩種新的自發(fā)性肝癌小鼠模型，其中pTMC小鼠主要發(fā)展為HCC，pTMK小鼠主要發(fā)展成ICC，以此得到的共17780個中性粒細胞被分成12個簇，顯示出清晰的組織特異性和有序的發(fā)育軌跡，與人類中的中性粒細胞異質性一致。

圖4 人類中性粒細胞異質性和功能驗證

4. 減少中性粒細胞可緩解腫瘤病情

上述分析結果為在小鼠模型中研究基于中性粒細胞的治療提供了基礎，基于此，研究者們分析了體內針對TIME-ISM TAN（Neu_09/10/11）消除這些促腫瘤TAN亞群的治療效果。由于沒有針對Neu_09/10/11的組合體內消除策略，研究采用抗Ly6G抗體37的中性粒細胞清除以模擬此類治療方法，結果發(fā)現(xiàn)中性粒細胞減少會導致肝癌結節(jié)和腫瘤重量的顯著減少。從本質上來講，該過程主要是由于中性粒細胞耗竭可以減弱巨噬細胞募集和T細胞抑制，從而產生對腫瘤的抑制作用。并通過對8個獨立樣本進行scRNA-seq，進一步研究了抗Ly6G治療期間的中性粒細胞動力學，證實在小鼠模型中，中性粒細胞的耗竭可以改變TAN的組成并減弱腫瘤的進展。

圖5 小鼠模型中中性粒細胞的異質性和耗竭影響

5. 總結與展望

總結一下，這篇工作基于對~1.3?億細胞進行大規(guī)模、無分類的單細胞分析，得到了PLC的全面細胞圖譜，分出了五種TIMELASER亞型并解碼中性粒細胞異質性，并且也詳細鑒定了一種在人類和小鼠之間廣泛保守的中性粒細胞譜，并推測促腫瘤CCL4⁺、SPP1⁺和PD-L1⁺TANs是極具潛力的免疫治療靶點。對這些數據的深入分析、以及功能研究，將為腫瘤時間和時間串擾提供新的見解，也將有利于識別免疫細胞功能，并指導識別免疫治療的生物標志物或靶點。研究者們表示，進一步探索中性粒細胞對免疫療法和相關混雜臨床因素的影響，將為更好地理解TAN生物學提供新的方向，并推動發(fā)展治療肝癌的轉化研究路徑。