咸陽師范學(xué)院  李懷珠

各位老師，大家好，我是咸陽師范學(xué)院生命科學(xué)系李懷珠，按照“一麥叢承”第12組“與麥同行”組長董劍老師的安排，今天由我值日。我們組的成員還有郭艷萍老師、鄭興衛(wèi)老師、秦海英老師、朱展望老師、候成老師、韓業(yè)偉老師、馮國華老師、范祥云老師、盧志浩老師、張耀輝老師。非常感謝“一麥眾承”這個小麥育種交流平臺，通過平臺讓我學(xué)習(xí)了很多，受益匪淺。

小麥作為最主要的糧食作物之一，收獲籽粒是小麥栽培的主要目的。小麥籽粒從受精開始需要經(jīng)過長達35天以上的發(fā)育才能達到完熟，而達到形態(tài)建成只需要大約12天左右的時間，由此可見，雖然形態(tài)建成時間很短，但是卻決定小麥籽粒最終的形態(tài)及大小。研究形態(tài)建成期籽粒發(fā)育規(guī)律，對于正確認識小麥籽粒發(fā)育至關(guān)重要。本研究以普通小麥大粒材料P271為研究對象，從形態(tài)學(xué)觀察、測量和細胞學(xué)觀察、干重、鮮重測量幾個方面系統(tǒng)考察P271在形態(tài)建成期的發(fā)育特點，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

一、 材料與方法

從本實驗室收集的黃淮麥區(qū)幾百多份小麥骨干品種/品系中挑選大粒材料普通小麥P271，作為研究材料，對照為小粒材料中國春（CS）。P271自然條件下每年種植于陜西省楊凌試驗田正常田間管理。

1.1器材及設(shè)備

標示牌，記號筆，剪刀，游標卡尺，烘箱，電子天平，保鮮袋，解剖針，解剖刀，體式顯微鏡。

1.2形態(tài)學(xué)觀察

主穗第一個花藥露出穎殼時，對主穗掛牌標記，記為受精后0天（DAP0），分別于開花后2、4、6、8、10、12、15、20、30、40天取樣，每個樣隨機取20株，每株取穗子中部 4個小穗第一粒位幼嫩籽粒用于形態(tài)學(xué)觀察研究。分別隨機取DAP4、DAP8和DAP12的3粒，解剖分離出胚囊（生物學(xué)意義上的種子）和子房壁（果皮），再橫切和縱切，然后用體式顯微鏡分別對完整的籽粒、橫切面、縱切面、胚囊、子房壁觀察并拍照。

1.3測量及稱量

游標卡尺測量每 10粒籽粒的長、寬、厚，用千分之一的天平稱100個籽粒鮮重，后于 105℃烘烤 4小時，后轉(zhuǎn)入 80℃下烘干至恒重，稱干重，重復(fù)三次。

1.4統(tǒng)計分析

測量數(shù)據(jù)用Excle統(tǒng)計分析，Sigmaplot做圖。

1.5細胞學(xué)觀察（半薄切片法）

取P271在 DAP4，DAP8和DAP12籽粒3粒，用于半薄切片觀察。為保證固定和滲透充分，處理前，用刀片把 4天前的籽粒，切成兩半，4天后的籽粒橫切成約3mm的薄片，用于制樣。

制樣流程：

(1) 樣品浸于戊二醛中后于4℃冰箱固定過夜。

(2) 用0.1%的磷酸緩沖液時間梯度漂洗5次。分別為5min、10min、15min、20min、30min。

(3) 1%餓酸4℃，固定2h。（餓酸的量以剛好沒過樣品為宜）

(4) 用0.1%的磷酸緩沖液時間梯度漂洗5次。分別為5min、10min、15min、20min、30min。

(5) 用乙醇梯度脫水。分別為30%、50%、70%各15min，80%、90%各20min，100%30min。

(6) 100%丙酮脫水兩次，各30min。

(7) 滲透。丙酮 ：包埋劑EPON812=3 ：1滲透3h。丙酮 ：包埋劑EPON812=1 ：1滲透4-6h。丙酮 ：包埋劑EPON812=1 ：3滲透12h過夜。純包埋劑滲透兩次，每次24h。

(8) 包埋。重新?lián)Q新配制的包埋劑，放入樣品，扶正位置。小心操作防止起泡產(chǎn)生，并寫好編號。

(9) 將包埋板放入烘箱中，30℃烘24h，60℃烘48h。

(10) Leica切片機將包埋組織快切成1—2μm的組織薄片，用針頭將其移至載玻片上的蒸餾水滴上，通過水分子表面張力使得，使組織薄片展平，置于60—80℃條件下干燥，使薄片展平并粘牢。用pH5.5的1%甲苯胺藍染色，顯微鏡觀察并數(shù)碼照相。

(11) 用Leica超薄切片機切片，醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染色，透射電鏡觀察、照相。

二、結(jié)果

P271粒長8.64mm ±0.11mm，千粒重65.63g ±0.24g，是典型的大粒材料（圖2-1）。

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              圖2-1 P271與中國春籽粒大小比較

 2.1籽粒形態(tài)變化規(guī)律

                圖2-2 小麥籽粒發(fā)育形態(tài)變化
DAP:授粉后天數(shù)

對P271的觀察、稱量和統(tǒng)計結(jié)果表明，籽粒在受精后就開始迅速增長，從DAP0開始到DAP12前后，最明顯的變化是籽粒長度、寬度和厚度成倍增加，DAP4以前為圓錐形，之后慢慢過渡到橢球形，到DAP12時籽粒形態(tài)基本建成，之后的主要變化是營養(yǎng)物質(zhì)的積累使得籽粒進一步長寬、加厚，總體積會進一步增加，但是在完熟脫水后，籽粒的體積又縮小，長度、寬度和總體積基本上與DAP12時相等，即籽粒的大小在DAP 12時基本完成，籽粒發(fā)育達到了形態(tài)建成，調(diào)控籽粒大小的基因在DAP 12時，基本上完成了使命（圖2-2 A，圖2-3 A），整個發(fā)育時期，大小的變化呈S型曲線，DAP 15天以后長度增長曲線進入平臺期(圖2-3 A)；但是籽粒鮮重和干重的增長從DAP 10不斷增加，直到DAP 30才基本進入平臺期（圖2-3 C）。

籽粒各部分的外形變化表現(xiàn)為，在DAP4時胚乳處于游離胚乳核時期，胚囊中央被大液泡占據(jù)，到DAP8時形態(tài)完整的胚乳已經(jīng)建立起來，到DAP12時胚乳變得更加粘稠，形態(tài)進一步改變，兩側(cè)半球型胚乳進一步延伸，胚囊進一步增長，充滿了整個子房壁空間，使得胚囊與子房壁緊緊粘在一起（圖2-2 B，2-2 D）。對應(yīng)的子房壁在DAP4時非常厚，到DAP8時厚度比DAP4減少了一半左右，在DAP12時進一步變?。▓D2-2 C）。胚囊的增長和子房壁的增長并不協(xié)調(diào)一致，在前期，子房壁增長迅速而胚囊相對較慢，導(dǎo)致在DAP8時，胚囊和子房壁之間有明顯的空隙，之后胚囊迅速增長擠壓了空隙，使得胚囊充滿了子房（圖2-2 C，2-2 D，2-2 E）。

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         圖 2-3 小麥籽粒發(fā)育形態(tài)與重量變化

2.2細胞學(xué)變化規(guī)律

在考察外形變化的基礎(chǔ)上，用半薄切片法從細胞學(xué)水平研究DAP4到DAP12這個時期籽粒胚乳和子房壁的發(fā)育，由于橫切面上各部分差異較大，本研究選取代表不同部位的6個點，從籽粒腹股溝依次向上分別標記為1-5號，6號代表側(cè)面胚囊與子房壁過渡的區(qū)域，分別比較這些區(qū)域從DAP4到DAP8、DAP12的變化情況。

DAP4時子房壁較厚，子房壁所占橫切面的面積是胚囊的2倍以上（圖2-4 A），腹股溝較淺，子房壁細胞里充有大量的圓球形淀粉顆粒（圖2-4 B，2-4 F），到DAP8時，腹股溝進一步向里凹陷，細胞里淀粉顆粒變得更多，整個子房壁明顯變薄，厚度大約只有DAP4時期的一半（圖 2-4 A，2-4 F），到DAP12時，腹股溝深陷入籽粒，子房壁變的更薄，厚度大約只有3-5層細胞，從DAP4到DAP12的變化可見，子房壁外層的細胞較小，形狀不規(guī)則，靠近胚囊的細胞較大，較規(guī)則，發(fā)育過程中子房壁細胞大小沒有明顯變化，子房壁的橫切面面積幾乎沒有增加，只是細胞層數(shù)減少。 靠近腹股溝的維管束部分，細胞較小，分布密集，著色較深，能看到明顯的細胞分裂相的染色體分布，從DAP4到DAP12大小幾乎沒有變化（圖2-4 C）。

胚囊部分在DAP4時，胚囊中央被含有液體的大液泡及大量的游離胚乳核充滿，游離的胚乳核形狀較規(guī)則，呈橢球形或球形，核仁明顯，這一時期的胚乳細胞還沒有形成細胞壁，處于游離狀態(tài)（圖2-4 A， 2-4 D， 2-4 G）。到DAP8時，游離胚乳核的細胞壁已經(jīng)發(fā)育完成，形成了完整的胚乳細胞，整個胚囊被胚乳細胞填充滿，已經(jīng)能看到淀粉顆粒的積累（圖2-4 A，2-4 D， 2-4 G）。DAP12時，整個胚囊橫切面面積繼續(xù)增大，胚囊的體積增長迅速，相比DAP8胚乳細胞大小幾乎沒變，胚乳細胞中淀粉顆粒數(shù)目明顯比DAP8是增多且增大，出現(xiàn)淀粉顆粒聚集（圖2-4 A，2-4 D，2-4 G）。

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             圖 2-4 P271籽粒發(fā)育細胞學(xué)變化

小麥籽粒研究中大部分關(guān)注灌漿和物質(zhì)積累，而對籽粒發(fā)育的形態(tài)建成關(guān)注的相對較少，盡管灌漿效率的高低直接決定小麥的產(chǎn)量和面粉的品質(zhì)，但是形態(tài)建成直接決定了籽粒的大小，籽粒大小與千粒重有極高的相關(guān)性，所以，研究小麥籽粒發(fā)育的形態(tài)建成規(guī)律和調(diào)控機制就顯的尤為重要。本研究所用的材料P271是一個育種上應(yīng)用的大粒材料，其籽粒大小是生產(chǎn)上推廣品種的1.5倍左右，不但是很好的育種資源材料，也是遺傳學(xué)研究的好材料，通過對P271籽粒發(fā)育過程中形態(tài)學(xué)和細胞學(xué)考察，明確了這個材料籽粒發(fā)育的特點，從形態(tài)和細胞學(xué)的結(jié)果可見，整個籽粒發(fā)育的進程是典型的S型生長曲線，但是仔細研究，發(fā)現(xiàn)籽粒的外形變化主要發(fā)生在DAP0至DAP12這一時期內(nèi)，之后進入平臺期，生長曲線的斜率趨近于0，同一時期，干物質(zhì)的積累速率卻在增加，當把長度的生長曲線和干物質(zhì)的積累曲線放到一個坐標系內(nèi)考察時，可以看出兩條生長曲線的斜率明顯不同（圖2-5）。以DAP8為分界點，分別考察從DAP4到DAP8，以及DAP8到DAP12這兩個階段中，長度和干物質(zhì)積累的曲線的斜率變化情況，由圖可見長度的曲線的斜率從DAP8開始下降，而干重的斜率卻從DAP8開始增加。小麥籽粒屬于穎果，通常所說的小麥籽粒的大小是指穎果，包含子房壁和胚囊，成熟小麥籽粒的子房壁緊緊貼在胚囊外面，籽粒的大小也就等同于穎果的大小。但是在發(fā)育的前期，無論從生長曲線的斜率還是從解剖的結(jié)果（圖2-2 D）都可見籽粒的大小和重量其實是獨立的，由此推測它們發(fā)育的調(diào)控機制也是獨立不同的。籽粒的大小并不能代表籽粒的重量，當籽粒大小相同但重量不同時可能是胚乳的充實程度不同，也可能是胚囊與子房壁之間的空隙大小不同，前者是灌漿效率和干物質(zhì)積累能力決定的，而后者是子房壁生長和胚囊生長差異決定的，在生產(chǎn)上我們往往忽視了這個問題，把兩種性質(zhì)不同，結(jié)果相同的現(xiàn)象解釋為一種機理，可能嚴重影響對籽粒發(fā)育機理的理解和應(yīng)用，就遺傳學(xué)研究而言，要探討不同遺傳背景的籽粒發(fā)育機制，必須要清楚這一點。

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                圖2-5 長度和干重曲線比較

2.3結(jié)論

本研究通過對P271籽粒發(fā)育時期的觀察和統(tǒng)計，分別從形態(tài)學(xué)和細胞學(xué)的角度考察了籽粒發(fā)育的特點，由生長曲線斜率的差異，推測控制籽粒形態(tài)建成和干物質(zhì)積累分子機制是獨立的，為后續(xù)從分子水平上研究發(fā)育調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。我們用P271和一些小粒材料做了一些群體，希望有機會和做相關(guān)研究的老師進行合作。