中國科學(xué)院北京生科院孫中生團隊、溫州醫(yī)科大學(xué)、首都兒科研究所合作，在Advanced Science上，在線發(fā)表了題為Loss-of-Function of p21-Activated Kinase 2 Links BMP Signaling to Neural Tube Patterning Defects的研究論文。該研究聚焦神經(jīng)管畸形的致病機制，綜合運用神經(jīng)生物學(xué)、人類遺傳學(xué)、多組學(xué)等技術(shù)手段，在多種模式生物中揭示了PAK2調(diào)節(jié)背外側(cè)鉸鏈點形成和神經(jīng)管發(fā)育及其功能異常所致神經(jīng)管畸形的致病機理，為探究神經(jīng)管畸形的病理機制提供了嶄新視角。

神經(jīng)管是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的基礎(chǔ)，在胚胎后期發(fā)育成腦和脊柱。在脊椎動物中，神經(jīng)管閉合是高度復(fù)雜的動態(tài)調(diào)控過程，涉及許多由遺傳和表觀遺傳因素精確控制的細(xì)胞事件。神經(jīng)管閉合異常會導(dǎo)致神經(jīng)管畸形。神經(jīng)管畸形致死率和致畸率較高，給患者家庭帶來沉重的經(jīng)濟與精神負(fù)擔(dān)。神經(jīng)管畸形是胎兒和新生兒中最嚴(yán)重的出生缺陷類疾病之一。 

PAK家族是一類可以調(diào)控細(xì)胞骨架的蛋白激酶。該團隊的前期研究確定了PAK2在腦發(fā)育中的重要功能，并闡明了PAK2在自閉癥發(fā)病中的分子機制（Wang et al., 2018）。本研究發(fā)現(xiàn)Pak2純和缺失小鼠在胚胎期9.5天時發(fā)育遲緩，表現(xiàn)出顱脊柱裂的表型。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎期9.5天時，Pak2純和缺失小鼠未能在后腦和脊柱部位抬起雙側(cè)神經(jīng)板，導(dǎo)致背外側(cè)鉸鏈點形成失敗。這提示PAK2基因?qū)τ谡麄€頭尾胚軸的背外側(cè)彎曲是必要的。研究通過分析胚胎期9.5天的轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，Pak2純和缺失小鼠的差異表達(dá)基因顯著富集到初級神經(jīng)管形成、前腦、中腦、后腦發(fā)育、模式特化過程和脊柱發(fā)育過程。這些差異表達(dá)基因還顯著地富集于BMP信號通路。BMP信號通路的多個配體，如BMP4/5和下游Smad9的磷酸化水平，均在Pak2純和缺失小鼠中顯著增加?？蒲袌F隊進(jìn)一步將Smad9蛋白417位點絲氨酸突變后可減弱PAK2和Smad9蛋白的相互作用，并解除PAK2對Smad9蛋白465位點絲氨酸磷酸化的抑制。上述工作提示PAK2可通過調(diào)控Smad9蛋白的磷酸化水平，從而抑制BMP信號通路，促使雙側(cè)神經(jīng)板的抬起和神經(jīng)管背外側(cè)鉸鏈點形成。 

單細(xì)胞測序技術(shù)進(jìn)一步顯示，Pak2純和缺失后可影響中胚層細(xì)胞向神經(jīng)管及前腦和脊柱的分化軌跡，使得與神經(jīng)管和神經(jīng)管發(fā)育而成的前腦、后腦、脊柱等相關(guān)的細(xì)胞類型顯著下降。與野生型胚胎相比，Pak2純和缺失胚胎的神經(jīng)管發(fā)育分?jǐn)?shù)及前腦（尤其是間腦部分）發(fā)育分?jǐn)?shù)降低。同時，BMP信號通路及該信號通路中的基因表達(dá)在Pak2純和缺失胚胎中增加。這提示Pak2純和缺失胚胎中異常的分化時序與異常的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)相關(guān)。 

該團隊在流產(chǎn)的神經(jīng)管畸形胎兒中檢測到5個位于PAK2基因的點突變。研究運用NanoString檢測方法，發(fā)現(xiàn)攜帶PAK2突變的胎兒腦組織中PAK2的水平降低而BMP信號通路中多個基因的水平增加。同時，研究發(fā)現(xiàn)PAK2突變點可影響PAK2蛋白的穩(wěn)定性，抑制ATP轉(zhuǎn)化ADP的水平，顯著降低PAK2的活性形式pPAK2的水平，提示該突變位點影響PAK2激酶活性。 

研究在斑馬魚中用CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了pak2a的特異敲除模型。該模型在出生后48小時后在頭部背前側(cè)區(qū)域出現(xiàn)了一個明顯的空腔，提示其神經(jīng)管發(fā)育異常。研究在敲除pak2a的斑馬魚中過表達(dá)神經(jīng)管畸形患者攜帶的PAK2突變位點，發(fā)現(xiàn)不能改善斑馬魚神經(jīng)管畸形的表型。 

綜上，該研究以神經(jīng)管特定發(fā)育事件（背外側(cè)鉸鏈點形成）為出發(fā)點、從細(xì)胞動態(tài)時序發(fā)育過程（單細(xì)胞測序技術(shù)）、分子機制（磷酸化激酶活性）和信號通路（BMP通路）等多水平，在多種脊椎類生物中闡明了PAK2在神經(jīng)管發(fā)育的作用機制。 

圖1.Pak2純和缺失胚胎中異常的分化時序