在面對(duì)外界形形色色的病原時(shí)，我們體內(nèi)種類繁多的天然功能抗體組成了一道強(qiáng)有力的免疫防線保衛(wèi)了我們的健康。時(shí)至今日，隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究人員已經(jīng)可以在體外分離、純化制備抗體，并直接促使了抗體藥物的誕生。

抗體藥物

自從1986年第一個(gè)治療性抗體莫羅單抗-CD3（Muromonab-CD3）進(jìn)入臨床應(yīng)用以來，相繼已經(jīng)有一百多種治療性抗體藥物進(jìn)入臨床應(yīng)用，且每年都有新的抗體藥物處于研發(fā)和上市過程中。

圖1. 常見抗體藥物。包括CD3單抗，用于治療多種癌癥；英夫利西單抗(Infliximab) ，用于治療免疫系統(tǒng)紊亂如克羅恩?。话⑦_(dá)木單抗（Adalimumab），用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎； 依那西普單抗(Etanercept)，用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[1]。

隨著技術(shù)的發(fā)展，抗體篩選和發(fā)現(xiàn)的常用技術(shù)有噬菌體展示技術(shù)，轉(zhuǎn)基因鼠雜交瘤技術(shù)和單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)。噬菌體展示技術(shù)實(shí)現(xiàn)了蛋白/多肽基因型與表型的統(tǒng)一，利用已有的基因片段可以快速的篩選得到所需抗體，但是其對(duì)文庫的依賴度比較高，無法應(yīng)對(duì)抗體種類的多樣性和復(fù)雜性。轉(zhuǎn)基因鼠雜交瘤技術(shù)不需要經(jīng)過傳統(tǒng)的分子生物學(xué)表達(dá)重組抗體步驟，只需經(jīng)過動(dòng)物免疫、細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞融合、小鼠腹水制備和單抗純化就可以完成目標(biāo)抗體制備，但其仍然存在操作復(fù)雜，難度大，成功率低等缺點(diǎn)。單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)具有效率高、人源性全、基因多樣性豐富等優(yōu)點(diǎn)。然而，迄今為止，單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)的應(yīng)用潛力尚未發(fā)揮出來。單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)仍受到一些實(shí)際條件的限制，如高通量PCR抗體基因擴(kuò)增技術(shù)不完善、某些靶抗原制備困難、對(duì)合適的人類供體需求量大等。而依賴于蛋白質(zhì)從頭測(cè)序的抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)操作簡(jiǎn)便快捷，不依賴任何抗體文庫，并且可以應(yīng)對(duì)各種各樣的抗體檢測(cè)，因而越來越受到抗體藥物發(fā)現(xiàn)及研發(fā)者的關(guān)注和青睞。

圖2.（左）噬菌體展示技術(shù)篩選單抗[2]，可快速篩選得到目標(biāo)抗體但其對(duì)文庫的依賴度比較高，無法應(yīng)對(duì)抗體種類的多樣性和復(fù)雜性；（右）轉(zhuǎn)基因鼠雜交瘤技術(shù)，不需要經(jīng)過傳統(tǒng)的分子生物學(xué)表達(dá)重組抗體步驟，但其仍然存在操作復(fù)雜，難度大，成功率低等缺點(diǎn)。

蛋白質(zhì)測(cè)序

抗體序列的發(fā)現(xiàn)有賴于基因測(cè)序和蛋白質(zhì)測(cè)序。與基因測(cè)序相比，蛋白質(zhì)測(cè)序產(chǎn)生的隨機(jī)匹配要少得多，更有利于新抗體序列的發(fā)現(xiàn)。在蛋白質(zhì)測(cè)序方法中，目前常用的有三種方法：基于Edman降解法的測(cè)序、肽譜分析和蛋白質(zhì)從頭測(cè)序（De novo sequencing）。其中，由于蛋白質(zhì)從頭測(cè)序具有不依賴任何蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，可以對(duì)任何未知蛋白質(zhì)進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序的優(yōu)勢(shì)而成為獲得蛋白序列的首選技術(shù)。

圖3.三種蛋白質(zhì)測(cè)序方法對(duì)比[3]。Edman降解法只能對(duì)N末端幾十個(gè)氨基酸序列進(jìn)行測(cè)定，肽譜分析需要依賴已有蛋白數(shù)據(jù)庫，而蛋白質(zhì)從頭測(cè)序（De novo sequencing）可以不依賴任何蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，對(duì)未知蛋白質(zhì)從頭測(cè)序。

目前，基于蛋白質(zhì)從頭測(cè)序發(fā)展而來的抗體測(cè)序技術(shù)已逐步受到包括基礎(chǔ)研究和抗體藥物開發(fā)人員的關(guān)注?？煨蛏锏目贵w發(fā)現(xiàn)平臺(tái)可以直接高效地發(fā)現(xiàn)在免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用且具高親和力的天然抗體，便于生產(chǎn)重組抗體，為抗體研發(fā)提供全新途徑。

圖4.快序抗體發(fā)現(xiàn)平臺(tái)

快序生物抗體發(fā)現(xiàn)平臺(tái)僅僅需要1 mg抗原親和純化的多克隆抗體，或3-5 mL血液的樣品量，再利用多種酶將包含多種抗體的蛋白樣本水解為短肽，進(jìn)一步通過使用高精度質(zhì)譜儀(Thermo Orbitrap Fusion)進(jìn)行檢測(cè)，以及從頭測(cè)序算法將串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)變?yōu)槎屉男蛄?，最終將短肽序列組裝回完整的高質(zhì)量的抗體蛋白質(zhì)序列。

快序生物自主研發(fā)的蛋白從頭測(cè)序技術(shù)突破了樣品的限制，可以在復(fù)雜樣品中獲得蛋白序列，打破傳統(tǒng)蛋白組學(xué)的數(shù)據(jù)庫依賴性，真正實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白質(zhì)的從頭測(cè)序。其中，上海快序生物科技有限公司在其20多年的技術(shù)積累上，對(duì)抗體測(cè)序技術(shù)進(jìn)行了持續(xù)優(yōu)化和升級(jí)，開發(fā)出了更加簡(jiǎn)易、迅速和準(zhǔn)確的抗體測(cè)序平臺(tái)。快序生物的蛋白從頭測(cè)序技術(shù)平臺(tái)的技術(shù)優(yōu)勢(shì)具體表現(xiàn)為：

1、更簡(jiǎn)易，突破樣品局限

運(yùn)用我們開發(fā)的獨(dú)特蛋白從頭測(cè)序技術(shù)可在復(fù)雜樣品中獲得蛋白序列，打破傳統(tǒng)蛋白組學(xué)的數(shù)據(jù)庫依賴性，真正實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白質(zhì)的從頭測(cè)序。

2、更迅速，高通量測(cè)序獲取信息

通過高通量測(cè)序在工作中更快地獲取信息，并識(shí)別其他方法無法找到的特殊高質(zhì)量分子，大大縮減獲取蛋白測(cè)序結(jié)果的時(shí)間。

3、更嚴(yán)謹(jǐn)，百分百確保序列精度

該核心技術(shù)，確保了每一個(gè)氨基酸的正確性和全抗體的序列精度，抗體測(cè)序技術(shù)可確保序列的每個(gè)位點(diǎn)的氨基酸有超過十種不同的肽段支持，并在氨基酸水平上進(jìn)行質(zhì)量控制，確保每個(gè)氨基酸在質(zhì)譜里有強(qiáng)的離子片段峰證據(jù)，可在抗體測(cè)序中準(zhǔn)確區(qū)分Leu/Ile殘基。

快序抗體發(fā)現(xiàn)平臺(tái)應(yīng)用場(chǎng)景

基于以上特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，快序生物的抗體發(fā)現(xiàn)服務(wù)已經(jīng)在眾多領(lǐng)域得到了充分應(yīng)用。這些實(shí)際應(yīng)用更加凸顯了快序生物在抗體發(fā)現(xiàn)方面的專業(yè)性和行業(yè)領(lǐng)先性。

1、腫瘤中新的天然抗體發(fā)現(xiàn)：靶向治療已經(jīng)在許多腫瘤臨床治療中進(jìn)行應(yīng)用，而靶向治療的基礎(chǔ)就是對(duì)于腫瘤中各種天然抗體的發(fā)現(xiàn)。2022年發(fā)表于Cell的一篇題為《Tumor-reactive antibodies evolve from non-binding and autoreactive precursors》[4]的研究中提出了一種利用患者體內(nèi)天然抗體治療腫瘤的新方法。這種方法克服了目前依賴于已有蛋白序列開發(fā)靶向藥的缺點(diǎn)，為開發(fā)新型靶向藥提供了技術(shù)支持。而利用快序生物的蛋白發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，研究人員可以快速對(duì)于體內(nèi)不同的天然抗體進(jìn)行快速鑒定和開發(fā)，從而加速藥物研發(fā)進(jìn)程。

2、前文中我們已經(jīng)提到抗體藥物目前已經(jīng)成為生物醫(yī)藥里的重要組成部分。而在面向未來的抗體藥物研發(fā)中，使用患者自身來源的天然抗體制備抗體藥物已成為一個(gè)重要的研究方向。2022年在國(guó)際頂級(jí)期刊Science Advances上發(fā)表的一篇題為《Rapid, site-specific labeling of “off-the-shelf” and native serum autoantibodies with T cell–redirecting domains》的研究性文章中，研究人員開發(fā)了一種可以將 T 細(xì)胞重定向結(jié)構(gòu)域特異性共價(jià)連接到任何現(xiàn)成的人免疫球蛋白G（IgG）或血清中分離的天然 IgG，只需數(shù)小時(shí)即可生成雙特異性抗體的技術(shù)。該技術(shù)可以使用癌癥患者自身的抗體來發(fā)現(xiàn)和治療自身癌癥，從而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療和個(gè)性化治療。而利用快序生物的抗體發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，我們可以快速準(zhǔn)確的對(duì)生物體內(nèi)的新抗體進(jìn)行測(cè)序鑒定，從而將上述實(shí)驗(yàn)室成果快速推進(jìn)至臨床，加快新型抗體藥物研發(fā)速度[5]。

3、自身免疫性疾病治療性抗體的研發(fā)：許多自身免疫性疾病的發(fā)病是因?yàn)橹虏⌒悦庖咔虻鞍譍（IgG）抗體的產(chǎn)生，隨后形成的免疫復(fù)合物從而對(duì)正常的細(xì)胞和組織產(chǎn)生毒害和攻擊作用，危害人類健康。而通過快序生物的抗體發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，不依賴于已有的蛋白數(shù)據(jù)庫，可以迅速的對(duì)患者血液中的抗體進(jìn)行分離檢測(cè)，從而開發(fā)出有針對(duì)性的治療抗體，從而開發(fā)針對(duì)性的臨床治療方案。

4、干預(yù)后免疫應(yīng)答的識(shí)別：通過快序生物的抗體測(cè)序平臺(tái)可以對(duì)免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的天然后的抗體水平進(jìn)行快速評(píng)估和干預(yù)。

5、多抗轉(zhuǎn)化為單抗或單抗混合物：根據(jù)抗體識(shí)別抗原表位的數(shù)量是否單一，抗體被分為單抗而多抗，而單抗的靶向治療效果優(yōu)于多抗，是臨床開發(fā)抗體藥物的首選。然而，單抗的開發(fā)過程耗時(shí)耗力，且技術(shù)難度較大。而在快速生物抗體發(fā)現(xiàn)平臺(tái)的支持下，可以將方便制備的多抗快速進(jìn)行分析檢測(cè)，從而轉(zhuǎn)化為特異性單抗或單抗混合物，加快了單抗的制備過程。

總結(jié)

隨著人類醫(yī)療衛(wèi)生水平的不斷增加，抗體已經(jīng)在臨床診療中發(fā)揮了越來越重要的作用，各種抗體生物制品的研發(fā)也是生物醫(yī)藥領(lǐng)域的重要組成部分。然而，耗時(shí)耗力技術(shù)難度大限制了抗體制品的制備和研發(fā)?；诖?，快序生物打造的抗體發(fā)現(xiàn)品平臺(tái)，不僅突破了樣品種類和數(shù)量的限制，還提高了速度和精準(zhǔn)度，極大降低了抗體制品的研發(fā)周期。

選擇快序生物抗體發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，讓抗體研發(fā)不再“卡脖子”！

參考文獻(xiàn)：

[1] Smith, Susan L. "Ten years of Orthoclone OKT3 (muromonab-CD3): a review." Journal of Transplant Coordination 6.3 (1996): 109-121.

[2] Diebolder, P., & Krawczyk, A. (2017). Detailed Protocols for the Selection of Antiviral Human Antibodies from Combinatorial Immune Phage Display Libraries. In (Ed.), Antibody Engineering. IntechOpen

[3] Janin-Bussat, Marie-Claire, et al. "Characterization of antibody drug conjugate positional isomers at cysteine residues by peptide mapping LC–MS analysis."Journal of Chromatography B 981 (2015): 9-13.

[4] Roei D. Mazor et al, Tumor-reactive antibodies evolve from non-binding and autoreactive precursors, Cell (2022).

[5] Zappala F, Higbee-Dempsey E, Jang B, et al. Rapid, site-specific labeling of "off-the-shelf" and native serum autoantibodies with T cell-redirecting domains. Sci Adv. 2022.

[6] Mu?oz-Durango N, Pizarro-Ortega MS, Rey-Jurado E, Díaz FE, Bueno SM, Kalergis AM. Patterns of antibody response during natural hRSV infection: insights for the development of new antibody-based therapies. Expert Opin Investig Drugs. 2018.

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