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細胞外囊泡 (EV) 是由所有細胞類型分泌到細胞外空間的納米級囊泡，包括大腦中的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞。EV在腦生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，例如廢物清除、細胞間通訊以及將保護性或致病性物質(zhì)運輸?shù)郊毎饪臻g。來自美國內(nèi)森·S·克萊恩精神病研究所的研究人員制定了一種基于碘克沙醇梯度的從腦組織中分離EV的方法，特別是揭示了除了微囊泡和外泌體的第三種EV亞型——線粒體囊泡。該標準化程序的推出，將為科學界研究這些不同類別的生物活性EV在生理環(huán)境以及神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)退行性疾病中的功能提供了寶貴的資源。相關(guān)成果以“Isolation of mitochondria-derived mitovesicles and
subpopulations of microvesicles and exosomes from brain tissues”為題在8月12日的Nature Protocols雜志上在線發(fā)表。
圖A：將EV從右側(cè)小鼠半腦中分離出來的程序示意圖。B：腦EV分離過程中最重要步驟的代表性照片。C：腦EV亞群分離過程中最重要步驟的代表性照片。在 200,000g 過夜超速離心前后顯示，裝載腦EV的蔗糖低分辨率梯度（左）和碘克沙醇高分辨率梯度（中）的比較。細胞外囊泡 (EV) 由所有細胞類型（涵蓋原核生物、植物、動物及人類細胞）組成性地產(chǎn)生并釋放到細胞外環(huán)境中。傳統(tǒng)上認為，EV分為兩個主要亞群，微囊泡（microvesicles，也被寫作ectosomes或oncosomes）和外泌體（exosomes）。微囊泡是較大的 (100–1,000 nm) EV亞群，由富含膽固醇的質(zhì)膜微區(qū)向外出芽產(chǎn)生。外泌體是較小的 (50-150 nm) EV亞群，起源于內(nèi)體區(qū)室，在完全成熟的晚期內(nèi)體（也稱為多泡體）與質(zhì)膜融合后釋放。在過去的二十年里，數(shù)據(jù)表明，EV的生物活性是復雜的，因為它們一旦被受體細胞內(nèi)化，就可以調(diào)節(jié)多種途徑，包括炎癥、細胞存活和細胞遷移。因此，EV被認為是細胞間通信的重要參與者。在腦生理學的背景下，EV通過在細胞之間傳遞神經(jīng)營養(yǎng)因子而具有神經(jīng)保護功能。此外，大量研究表明，EV可以在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。例如，EV 攜帶關(guān)鍵的致病蛋白，如朊病毒蛋白、亨廷頓蛋白及其毒性mRNA、tau、淀粉樣蛋白β前體蛋白 (APP) 和 APP 代謝物，并在整個大腦中傳播。因此，EV在神經(jīng)退行性疾病中具有多效性作用：EV通過排出細胞內(nèi)有害物質(zhì)來減輕神經(jīng)元壓力，但也可以通過在整個大腦中運輸神經(jīng)毒性分子來促進腦疾病的傳播。來自不同細胞內(nèi)和質(zhì)膜區(qū)室的EV亞群在腦細胞的穩(wěn)態(tài)中具有不同的作用，因此它們對神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展有不同的貢獻。因此，研究EV異質(zhì)性和復雜性將揭示大腦中的生理和病理過程，并為藥物成癮和復雜腦部疾病的進展提供新的見解（如朊病毒病、阿爾茨海默病和帕金森病）。研究已經(jīng)表明，在這些情況下，胞內(nèi)體途徑和質(zhì)膜外體途徑之間存在特定的相互關(guān)系。例如，研究表明，長期暴露于可卡因的小鼠大腦中發(fā)生的內(nèi)體功能障礙以及唐氏綜合癥、阿爾茨海默病和脊髓小腦共濟失調(diào)的早期階段會影響外泌體分泌到大腦和小腦細胞外空間。相反，載脂蛋白等位基因ε4（散發(fā)性阿爾茨海默病的主要遺傳風險因素）的人類和鼠類攜帶者的大腦中顯示出相反的情況，其中外泌體分泌失調(diào)先于內(nèi)體病理學。唐氏綜合征中微囊泡的分泌不受影響，而線粒體生物學發(fā)生改變，可能與線粒體功能障礙有關(guān)。除了微囊泡和外泌體，研究人員發(fā)現(xiàn)，還存在第三種類型的EV，在細胞內(nèi)來源于線粒體，命名為mitovesicle（線粒體囊泡）。在此背景下，線粒體囊泡的研究開辟了一個新的領(lǐng)域。人們發(fā)現(xiàn)，血小板釋放線粒體成分，除了“細胞外游離線粒體”，還可在血液中檢測到其他的線粒體個體，它比整個線粒體更?。▇100-200 nm）。數(shù)據(jù)表明，這些血液中的線粒體個體是線粒體囊泡。在神經(jīng)退行性變的背景下，研究腦實質(zhì)中的線粒體囊泡生物學可以為識別血液中的生物標志物提供新的方向。例如，從阿爾茨海默病患者血漿中分離出的循環(huán) EV，與沒有病理的對照相比具有更高水平的線粒體mRNA (mtRNA)。鑒于線粒體損傷是阿爾茨海默病中發(fā)現(xiàn)的典型表型，并且鑒于線粒體囊泡含有mtRNA和mtDNA，這一證據(jù)與在大腦中的數(shù)據(jù)一致，因為在線粒體功能障礙和唐氏綜合癥小鼠模型的腦實質(zhì)中更高水平的線粒體囊泡。在這篇文章中，研究人員給出的實驗方法，將在特定的碘克沙醇梯度中將線粒體囊泡 (50–300 nm) 從其他小型EV中分離出來，從而能夠?qū)ζ溥M行識別和后續(xù)研究。研究人員詳細的制定了一個標準化的方法，用于從小鼠和人類大腦中可靠和一致地分離 EV（包括線粒體囊泡），只需要具有基本實驗室經(jīng)驗的工作人員在27小時內(nèi)就可以分離完畢。該方法包括對腦組織進行溫和的細胞外基質(zhì)消化、一系列過濾和離心步驟以純化 EV，以及基于碘克沙醇的高分辨率密度梯度梯度，可分離不同的 EV 種群，包括線粒體囊泡。研究人員還制定了詳細的下游流程，用于納米分析、電子顯微鏡和蛋白質(zhì)印跡對腦 EV制劑進行表征和分析，以及用于測量線粒體囊泡的ATP動力學。此外，將這種新穎的基于碘克沙醇的高分辨率密度階梯梯度與先前描述的基于蔗糖的梯度進行了比較。盡管回收的總EV的產(chǎn)量相似，但與基于蔗糖的梯度相比，基于碘克沙醇的梯度更好地分離不同的EV亞群，包括微泡、外泌體和線粒體囊泡的亞群。該技術(shù)可以在正常生理過程和病理性腦條件下（包括阿爾茨海默病和帕金森病等神經(jīng)退行性疾?。δXEV亞型進行定量、高度可重復的分析。圖：從碘克沙醇梯度組分8中采集到的線粒體囊泡的代表性電子顯微照片。參考文獻：Isolation of mitochondria-derived
mitovesicles and subpopulations of microvesicles and exosomes from brain
tissues. Nat Protoc. 2022;10.1038/s41596-022-00719-1
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