中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所司龍龍課題組在 Nature Biotechnology 期刊發(fā)表了題為：Generation of a live attenuated influenza A vaccine by proteolysis targeting 的研究論文。研究團(tuán)隊(duì)以流感病毒為模式病毒，建立了蛋白降解靶向病毒作為減毒疫苗的技術(shù)（Proteolysis-Targeting Chimeric virus vaccine，PROTAC疫苗），為疫苗開發(fā)提供了新思路。病毒感染與傳播嚴(yán)重危害人類健康和社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，已引起全球的高度關(guān)注。其中，流感是由流感病毒引起的一種呼吸道傳染病。流感病毒其抗原性易變，傳播迅速，每年可引起季節(jié)性流行。每年流感季節(jié)性流行在全球可導(dǎo)致300萬-500萬人重癥病例，29萬-65萬呼吸道疾病相關(guān)死亡。疫苗是預(yù)防和控制傳染病最為經(jīng)濟(jì)有效的手段之一。2021年 Science 將“下一代疫苗的開發(fā)”列為125個前沿科學(xué)問題之一（www.science.org/content/resource/125-questions-exploration-and-discovery）。減毒疫苗因其在免疫效果方面具備潛在優(yōu)勢而成為重要發(fā)展方向之一，如流感減毒疫苗可采用更為簡單、經(jīng)濟(jì)、無痛、且與自然感染途徑一致的鼻內(nèi)噴霧方式接種；可保留病毒全部或絕大部分抗原的天然結(jié)構(gòu)，可誘導(dǎo)更廣的免疫應(yīng)答，包括體液免疫、呼吸道黏膜免疫、細(xì)胞免疫等；可提供交叉免疫保護(hù)作用。蛋白質(zhì)作為病毒結(jié)構(gòu)組成和正常生命活動所必需的共性生命物質(zhì)，為人們操控病毒進(jìn)而利用病毒提供了重要切入點(diǎn)?；诘鞍踪|(zhì)調(diào)控的病毒減毒策略，大致可以歸納為兩個主要方面：一是抑制或阻斷蛋白質(zhì)合成以減少子代病毒組裝所需的“原料”生產(chǎn)，二是加速蛋白質(zhì)降解以及時將子代病毒組裝所需的“原料”清除。在本研究中，司龍龍團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了PROTAC病毒，旨在通過操控病毒蛋白質(zhì)的降解降低病毒的復(fù)制能力，將野生型病毒減毒成為疫苗。宿主細(xì)胞內(nèi)天然存在的蛋白質(zhì)降解機(jī)器“泛素-蛋白酶體系統(tǒng)”為PROTAC病毒疫苗的設(shè)計提供了關(guān)鍵生物學(xué)基礎(chǔ)。近年來，基于泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的PROTAC蛋白質(zhì)靶向降解技術(shù)，已經(jīng)被成功地用于開發(fā)基于化學(xué)小分子的蛋白降解劑，并成為國際科學(xué)研究熱點(diǎn)，即研究人員設(shè)計出一種具有兩個活性端的小分子化合物，一個活性端可以與需要降解的靶蛋白相結(jié)合，而另一個活性端可以與特定的E3泛素連接酶相結(jié)合，從而誘導(dǎo)靶蛋白的泛素化，進(jìn)而被蛋白酶體降解。在本研究中，司龍龍團(tuán)隊(duì)將宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)降解機(jī)器可選擇性降解靶蛋白的生物學(xué)機(jī)制，成功拓展至生命體—病毒疫苗的設(shè)計構(gòu)建。研究團(tuán)隊(duì)選擇流感病毒作為模式病毒，利用宿主細(xì)胞中天然存在的蛋白質(zhì)降解機(jī)器，設(shè)計可條件性操控病毒蛋白質(zhì)穩(wěn)定與降解的元件，工程病毒基因組，使得相應(yīng)的病毒蛋白在正常細(xì)胞中被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)識別而降解，導(dǎo)致病毒復(fù)制能力減弱，而成為潛在的疫苗；而在疫苗制備細(xì)胞中，病毒蛋白降解誘導(dǎo)元件會被選擇性移除，使得病毒蛋白得以保留，因此PROTAC病毒在疫苗制備細(xì)胞中可以高效復(fù)制而大量制備。根據(jù)上述設(shè)計原理，研究團(tuán)隊(duì)首先構(gòu)建了一株PROTAC流感病毒疫苗，命名為：M1-PTD。對病毒生長曲線考察發(fā)現(xiàn)，M1-PTD只能在PROTAC病毒制備細(xì)胞中高效復(fù)制而得以制備，而在正常細(xì)胞中復(fù)制能力顯著下降而安全。此外，免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，M1-PTD病毒蛋白在正常細(xì)胞中被降解；噬斑實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，M1-PTD僅在PROTAC病毒制備細(xì)胞中可以形成噬斑，而在正常細(xì)胞中不形成噬斑；細(xì)胞病變實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，M1-PTD在正常細(xì)胞中不引起明顯病變。所有這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明M1-PTD流感病毒具備成為安全疫苗的潛力。該團(tuán)隊(duì)對構(gòu)建的PROTAC流感病毒的工作機(jī)理進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，M1-PTD流感病毒的蛋白在正常細(xì)胞中被降解而復(fù)制減弱，而宿主細(xì)胞蛋白酶體的抑制可以恢復(fù)M1-PTD的病毒蛋白水平和復(fù)制能力，說明PROTAC流感病毒的蛋白降解和復(fù)制減弱是泛素-蛋白酶體途徑依賴的，符合設(shè)計原理。研究團(tuán)隊(duì)使用小鼠、雪貂動物模型對構(gòu)建成功的M1-PTD流感病毒進(jìn)行了安全性評價。將M1-PTD病毒或野生型流感病毒以滴鼻的方式接種于動物，監(jiān)測動物的死亡率和體重，并檢測動物鼻洗液、氣管、肺中的病毒滴度。結(jié)果顯示，與野生型病毒相比，M1-PTD在動物體內(nèi)的復(fù)制能力顯著降低，且不會引起小鼠死亡或體重下降，說明其在動物體內(nèi)具備安全性。研究團(tuán)隊(duì)在小鼠、雪貂動物模型中對M1-PTD流感疫苗進(jìn)行了免疫效果評價。結(jié)果顯示，M1-PTD可以誘導(dǎo)廣泛的免疫應(yīng)答，包括體液免疫、黏膜免疫、細(xì)胞免疫應(yīng)答；且 M1-PTD可以提供良好的交叉免疫保護(hù)。該研究基于合成生物學(xué)理念，將細(xì)胞的蛋白質(zhì)降解機(jī)器生物學(xué)機(jī)制拓展至生命體—病毒疫苗的設(shè)計，不僅為病毒疫苗開發(fā)提供了新思路，豐富了人類抵御病毒的疫苗技術(shù)武器庫，也有助于促進(jìn)細(xì)胞蛋白質(zhì)降解機(jī)器基礎(chǔ)生物學(xué)研究與疫苗研發(fā)醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化的深度交叉融合。同時該團(tuán)隊(duì)指出，雖然該研究在細(xì)胞和動物模型中證明了PROTAC病毒疫苗概念的可行性，但PROTAC病毒作為疫苗的潛在應(yīng)用仍需要大量的優(yōu)化和探索。
