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易基因｜組學(xué)研究：人類胎兒發(fā)育過(guò)程的DNA羥甲基化(5hmC)和RNA m5C動(dòng)態(tài)重編程 大家好，這里是專注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。 2022年5月26日，中國(guó)科學(xué)院研究團(tuán)隊(duì)合作以“Dynamic
DNA 5-hydroxylmethylcytosine and RNA 5-methycytosine reprogramming during early
human development”為題在權(quán)威學(xué)術(shù)期刊《Genomics Proteomics & Bioinformatics》（IF 7.691）發(fā)表研究論文，該研究通過(guò)微量DNA羥甲基化測(cè)序技術(shù)5hmC-Seal、RNA m5C甲基化檢測(cè)技術(shù)RNA-BS和對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組RNA-seq等組學(xué)測(cè)序結(jié)果揭示了人類胎兒發(fā)育過(guò)程的DNA 5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)和RNA 5-甲基胞嘧啶（m5C）動(dòng)態(tài)重編程機(jī)制。 標(biāo)題：Dynamic DNA 5-hydroxylmethylcytosine and RNA 5-methycytosine reprogramming during early human development 發(fā)表時(shí)間：2022年5月26日 期刊：Genomics Proteomics & Bioinformatics 影響因子：IF 7.691 技術(shù)方法：微量細(xì)胞DNA羥甲基化測(cè)序（5hmC-Seal）、 RNA重亞硫酸鹽測(cè)序（RNA-BS）、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）等（易基因優(yōu)勢(shì)技術(shù)） 研究摘要： 人胚胎植入后，復(fù)雜和高度專業(yè)化的分子事件呈現(xiàn)功能上不同的器官形成，而表觀基因組如何調(diào)控器官特異性發(fā)育仍有待闡明。本研究納入123個(gè)人13-28周胎兒的的心臟、腎臟、肝臟、肺器官樣本，通過(guò)微量5hmC-Seal、RNA-BS和RNA-seq等測(cè)序技術(shù)繪制了DNA 5hmC和RNA m5C表觀基因組圖譜。分別鑒定出70091個(gè)器官階段特異性差異羥甲基化區(qū)域（DhMR）和503個(gè)mRNA m5C修飾。發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（TFs）、T-box轉(zhuǎn)錄因子20（TBX20）、配對(duì)盒蛋白pax-8（PAX-8）、krueppel樣因子1（KLF1）、轉(zhuǎn)錄因子21（TCF21）和CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β（CEBPB）特別有助于在不同階段形成不同的器官。此外，分析結(jié)果還發(fā)現(xiàn)5hmC富集的Alu元件可以參與TF靶向基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。本研究揭示了DNA修飾和RNA甲基化之間的重要聯(lián)系，并說(shuō)明了人類胎兒器官發(fā)生過(guò)程中的表觀遺傳圖譜，為理解早期發(fā)育和出生缺陷的深入表觀遺傳機(jī)制提供了基礎(chǔ)。 研究背景： 表觀遺傳修飾包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)可及性、RNA修飾等。它不僅作為染色質(zhì)組織和結(jié)構(gòu)規(guī)范的可遺傳和穩(wěn)定指示，而且還參與哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的調(diào)節(jié)。人類胚胎和成人器官在生理和病理?xiàng)l件下的表觀基因組已被廣泛研究；然而，與人類胎兒器官正常發(fā)育有關(guān)的表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)仍不清楚。 方法： 在胎齡13-28周選擇性引產(chǎn)后的胎兒中獲得123個(gè)胎兒心臟、肝臟、腎臟和肺器官組織樣本（排除病理妊娠、異常核型或發(fā)育缺陷的胎兒組織）。解剖后分離所有正常器官，用醫(yī)用鹽水連續(xù)沖洗3次，立即液氮冷凍。隨后進(jìn)行基因組DNA和RNA制備，用于后續(xù)的微量5hmC-Seal、RNA-BS和RNA-seq測(cè)序分析。 結(jié)果： （1）人類胎兒器官全基因組DNA 5hmC分析 作者分別在13-15、18-19、21-23 和 25-28 周的 8 個(gè)人類胎兒中收集了心臟、腎臟、肝臟、肺 4 個(gè)主要器官的樣本，每個(gè)階段重復(fù) 2-4 次。為研究全基因組 DNA 5hmC 特征，進(jìn)行了微量細(xì)胞DNA羥甲基化測(cè)序（5hmC-Seal）。
圖1：早期人類胎兒發(fā)育的DNA 5hmC圖譜 A．人類胎兒器官的發(fā)育時(shí)間表和本研究中使用的器官樣本和策略示意圖。 B．器官特異性基因（TRDN，PAX2，RASA4B和FAM86FP）的IGV視圖。 C．DNA 5hmC在心臟，腎臟，肝臟和肺組織不同發(fā)育階段的Metagene圖。 D．相對(duì)于不同器官中預(yù)期的DhMRs和ChMRs在不同基因組區(qū)域的歸一化富集得分，正值表明富集程度超過(guò)預(yù)期。 E．DhMRs在不同器官轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）的分布。 F．不同器官樣品的器官和階段特異性DhMR中5hmC信號(hào)主成分分析（PCA）。 G．器官和階段特異性DhMR的5hmC信號(hào)熱圖。 H．器官和階段特異性DhMR的GREAT分析結(jié)果。 （2）人類胎兒器官發(fā)育過(guò)程中的DNA 5hmC重編程 5hmC 動(dòng)態(tài)變化分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子（TF）可能在胎兒5hmC水平動(dòng)態(tài)序列變化的幫助下參與特定器官的發(fā)育。表明DNA 5hmC可以作為表觀遺傳標(biāo)記 Alu 元件的過(guò)渡狀態(tài)，通過(guò)5hmC影響 TF 結(jié)合和下游基因表達(dá)。
圖2：DNA 5hmC通過(guò)TFs和TEs動(dòng)態(tài)促進(jìn)胎兒器官發(fā)育 A．心臟、腎臟、肝臟和肺部器官特異性DhMRs的K均值聚類分析，每個(gè)器官分為6個(gè)簇。 B．DhMRs鑒定的TF motifs熱圖。 C．胎兒腎臟器官和階段特異性DhMRs中特定TE家族的富集分析。 D．簇3和簇4中Alu元件CEBPB結(jié)合位點(diǎn)的富集分?jǐn)?shù)，與所有Alu元件CEBPB結(jié)合位點(diǎn)的總富集（紅色）及其全基因組分布（藍(lán)色）相比較條形圖。條形圖還顯示所有Alu元件所有CEBPB結(jié)合位點(diǎn)與其全基因組分布相比的富集情況（灰色）。 E．將D中CEBPB靶向Alu元件的5hmC信號(hào)和下游基因表達(dá)水平z評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)化。 （3）DNA 5hmC與人體器官的轉(zhuǎn)錄組穩(wěn)態(tài)相關(guān) 大多數(shù)DhMRs位于所有胎兒器官的TSS區(qū)域周圍（圖?1E）和DhMRs上5hmC信號(hào)的序列變化表明，在器官發(fā)育過(guò)程中，5hmC信號(hào)與RNA豐度密切相關(guān)（圖?2B和E）。因此，研究人員分析啟動(dòng)子上的DNA 5hmC動(dòng)態(tài)重編程是否在發(fā)育階段調(diào)控基因表達(dá)。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)域的5hmC修飾與胎兒器官發(fā)育期間的基因表達(dá)穩(wěn)態(tài)高度相關(guān)。
圖3：DNA 5hmC參與調(diào)控人類胎兒器官的基因表達(dá) A．啟動(dòng)子不同階段5hmC信號(hào)與基因表達(dá)水平的Pearson相關(guān)系數(shù)中位數(shù)。 B．胎兒器官發(fā)育過(guò)程中5hmC顯著減少和增加的基因數(shù)量。 C．每個(gè)器官中5hmC顯著變化的器官特異性基因的百分比。 D．5hmC信號(hào)的倍數(shù)變化（log2）和5hmC減少組/增加組18個(gè)器官特異性基因的基因表達(dá)水平。 E．雙標(biāo)圖（Biplots）比較5hmC信號(hào)（x軸）、DNase I超敏信號(hào)（y軸）的變化與RNA豐度變化（顏色）。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因。 F．心、腎、肝、肺不同TF家族組pearson相關(guān)系數(shù)的動(dòng)態(tài)變化?；?hmC信號(hào)和相應(yīng)基因組中的基因表達(dá)水平計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)。 （4）RNA m5C在胎兒器官發(fā)生過(guò)程的下游起調(diào)控作用 RNA m5C是與RNA穩(wěn)定性相關(guān)的普遍RNA轉(zhuǎn)錄后修飾之一，研究人員對(duì)13-28周三個(gè)時(shí)期的心、腎、肝、肺四個(gè)胎兒器官進(jìn)行RNA重亞硫酸氫鹽測(cè)序（RNA-BS）。結(jié)果揭示了在全基因組范圍內(nèi)，m5C修飾水平在腎、肝和肺的發(fā)育過(guò)程中動(dòng)態(tài)變化。進(jìn)一步結(jié)果表明，RNA m5C在人類胎兒器官發(fā)育過(guò)程中充當(dāng)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)器。
圖4：胎兒器官發(fā)育過(guò)程中的RNA m5C甲基化圖譜 A．心臟、腎臟、肝臟和肺不同樣本中不同區(qū)域的m5C分布。 B．m5C位點(diǎn)和m5C修飾mRNAs數(shù)量。 C．心臟、腎臟、肝臟和肺不同發(fā)育階段的總RNA m5C甲基化水平。 D．通過(guò)比較相鄰階段樣本的RNA序列數(shù)據(jù)，顯示m5C修飾和m5C不修飾的mRNAs表達(dá)水平變化累積分布。 E．器官和階段特異性基因的m5C甲基化水平與胎兒器官發(fā)育過(guò)程中相應(yīng)基因的表達(dá)水平之間的強(qiáng)正相關(guān)熱圖。 （5）DNA 5hmC和RNA m5C的特異性和協(xié)同作用 接下來(lái)，研究人員提出一種可能：DNA 5hmC和RNA m5C可能相互作用，在時(shí)空上調(diào)節(jié)胎兒器官的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。為進(jìn)一步研究DNA 5hmC和RNA m5C的各自功能，研究人員將器官特異性修飾基因分為4組：由DNA 5hmC和RNA m5C共同特異性調(diào)節(jié)的差異表達(dá)基因（A組）、僅由DNA 5hmC特異性調(diào)節(jié)的差異表達(dá)基因（B組）、僅由RNA m5C特異性調(diào)節(jié)的差異表達(dá)基因（C組）、由DNA 5hmC和RNA m5C特異性調(diào)節(jié)的常見表達(dá)基因（D組）。 分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在A組中，DNA 5hmC信號(hào)強(qiáng)度、RNA m5C甲基化水平和基因表達(dá)水平之間存在密切關(guān)聯(lián)。在胎兒腎臟和肝臟中，DNA 5hmC和RNA m5C可能表現(xiàn)出不同的特異性功能。進(jìn)一步結(jié)果表明，DNA 5hmC和RNA m5C可能分別通過(guò)轉(zhuǎn)錄前和轉(zhuǎn)錄后機(jī)制促進(jìn)器官特異性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這些機(jī)制由TET3和NSUN2/ALYREF介導(dǎo)。關(guān)于如何在機(jī)制上促進(jìn)發(fā)展過(guò)程，仍值得進(jìn)一步詳細(xì)研究。
圖5：DNA 5hmC和RNA m5C持續(xù)調(diào)節(jié)胎兒器官發(fā)育 A．DNA 5hmC-RNA m5C共調(diào)節(jié)特異表達(dá)基因（A組）的啟動(dòng)子DNA 5hmC信號(hào)（左）、m5C甲基化水平（中）和表達(dá)水平（右）動(dòng)態(tài)變化熱圖。DNA 5hmC信號(hào)、m5C甲基化水平和基因表達(dá)水平通過(guò)z評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)化。 B．A組、B組和C組中器官特異性基因的GO生物過(guò)程富集分析。 C．m5C修飾或不修飾相應(yīng)基因啟動(dòng)子上的5hmC信號(hào)。 D．胎兒器官中5hmC甲基轉(zhuǎn)移酶TET3和m5C“writer”NSUN2、“reader”ALYREF和YBX1的表達(dá)水平之間相關(guān)性。 結(jié)論： 綜上所述，這項(xiàng)研究不僅揭示了植入后胚胎器官發(fā)生過(guò)程中DNA 5hmC和RNA m5C的動(dòng)態(tài)重編程，而且還揭示了DNA修飾和RNA甲基化之間的相互作用。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組可以時(shí)空協(xié)同調(diào)節(jié)，在特定發(fā)育階段形成協(xié)同良好的網(wǎng)絡(luò)，確保胎兒正常發(fā)育。此外，對(duì)DNA和RNA修飾水平的特征和功能重要性的全面描述提供了可用的人類胎兒表觀基因組數(shù)據(jù)集，并為深入理解人類早期發(fā)育的表觀遺傳學(xué)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
關(guān)于DNA羥甲基化 羥甲基化5hmC是哺乳動(dòng)物基因組上的第六堿基，在發(fā)育、衰老、神經(jīng)退行性疾病、復(fù)雜疾病及腫瘤發(fā)生過(guò)程中起重要作用。DNA羥甲基化是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的DNA修飾并迅速成為研究熱點(diǎn)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)之前被認(rèn)為是檢測(cè)DNA甲基化標(biāo)準(zhǔn)的重亞硫酸鹽測(cè)序并不能區(qū)分DNA甲基化（5mC）和DNA羥甲基化（5hmC）。 傳統(tǒng)BS轉(zhuǎn)化無(wú)法區(qū)分5mC和5hmC 傳統(tǒng)的Bisulfite測(cè)序中，5hmC經(jīng)過(guò)Bisulfite處理后變?yōu)镃MS，CMS在測(cè)序中仍然被讀作C堿基，因此不能區(qū)分5mC和5hmC。
易基因聯(lián)合劍橋大學(xué)建立了化學(xué)氧化法結(jié)合重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的測(cè)序技術(shù)（oxidative bisulfite sequencing, oxBS-Seq），該技術(shù)不僅可以精確檢測(cè)DNA甲基化，排除DNA羥甲基化的影響，還可以雙文庫(kù)結(jié)合同時(shí)單堿基分辨率精確檢測(cè)DNA羥甲基化。 易基因羥甲基化測(cè)序技術(shù)滿足多種應(yīng)用需求： l 全基因組氧化甲基化測(cè)序（oxWGBS） l 簡(jiǎn)化基因組氧化甲基化測(cè)序（oxRRBS） l 目標(biāo)區(qū)域靶基因氧化甲基化測(cè)序（Target-oxBS） l 羥甲基化DNA免疫沉淀測(cè)序（hMeDIP-seq/5hmC-Seal） 關(guān)于RNA m5C甲基化 m5C是RNA百余種修飾中研究較多的一種。m5C存在于tRNA上時(shí)，可以對(duì)翻譯進(jìn)行調(diào)節(jié)；存在于rRNA上時(shí)，可以對(duì)核糖體的生物合成進(jìn)行質(zhì)控；存在于mRNA上時(shí)，則可以影響mRNA的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性及翻譯過(guò)程。 易基因提供適用于不同科研需求的m5C甲基化測(cè)序技術(shù)： ? 常規(guī)mRNA m5C甲基化測(cè)序（RNA-BS）： mRNA分離后首先通過(guò)亞硫酸鹽處理，非甲基化的C轉(zhuǎn)變?yōu)閁，m5C修飾的堿基保持不變，結(jié)合高通量測(cè)序，可以對(duì)RNA上的每一個(gè)C堿基修飾進(jìn)行定位與定量。 ? 常規(guī)mRNA +lncRNA m5C甲基化測(cè)序（全轉(zhuǎn)錄組RNA-BS）： 易基因科技建立的升級(jí)版m5C RNA甲基化測(cè)序服務(wù)，去除人rRNA后，剩余RNA經(jīng)重亞硫酸鹽處理后，結(jié)合高通量NGS策略，可在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)單堿基分辨率地檢測(cè)基因m5C甲基化修飾分布。
技術(shù)優(yōu)勢(shì)： l 高深度：超高深度重亞硫酸鹽處理，檢測(cè)準(zhǔn)確性極高； l 高通量：結(jié)合高通量NGS，全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)檢測(cè)； l 單堿基：?jiǎn)螇A基分辨率，快速檢測(cè)和分析RNA中的m5C。 l 高準(zhǔn)確：精確的檢測(cè)mRNA等每一個(gè)C堿基的的修飾水平。 易基因技術(shù)團(tuán)隊(duì)多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析方法總結(jié) 1. 直接關(guān)聯(lián) 一個(gè)基因的功能元件甲基化情況影響該基因的表達(dá)。 · 重疊分析 · Pearson/Spearman 相關(guān)性分析 2. 模型關(guān)聯(lián) 基于基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)、代謝物等之間的上下游相互作用聯(lián)系。 · 多元線性模型(multiple linear model) 3. 網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián) 基于分子功能和通路的富集性。 · WGCNA module correlation · EMDN algorithm · SNF algorithm 從關(guān)聯(lián)走向因果：組學(xué)分子實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 基因表達(dá)相關(guān)的組學(xué)： l 基因敲除/抑制 l 基因過(guò)表達(dá) 甲基化組學(xué)： l 甲基化酶基因的敲除與過(guò)表達(dá) 宏基因組（腸道菌群）： l 無(wú)菌動(dòng)物模型 l 糞菌移植 有DNA/RNA甲基化測(cè)序或組學(xué)研究需求可致電易基因：0755-28317900 參考文獻(xiàn)： Han X,et al. Dynamic DNA 5-hydroxylmethylcytosine and RNA 5-methycytosine reprogramming during early human development. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2022 May 26. 更多閱讀： 項(xiàng)目集錦 | 易基因DNA羥甲基化5hmC測(cè)序研究成果 項(xiàng)目文章｜DNA(羥)甲基化研究揭示鐵離子依賴表觀調(diào)控促進(jìn)狼瘡致病性T細(xì)胞分化 |
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