在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）的官網(wǎng)中提到，所謂精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)指的是疾病預(yù)防與處置的新方法，該方法需要考慮患者在基因、環(huán)境以及生活習(xí)慣方面的個(gè)體差異。之所以提出精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)這樣的概念，是因?yàn)樵絹?lái)越多的臨床證據(jù)表明，根據(jù)患者的基因狀態(tài)而采取的針對(duì)性治療，其效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)的治療策略，而在這方面非常具有代表性的例子就是非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的EGFR 突變。本文就精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代下的EGFR 突變檢測(cè)方面進(jìn)行闡述，以饗讀者。

        自2004 年New England Journal of Medicine 和Science 雜志的兩項(xiàng)研究相繼發(fā)現(xiàn)EGFR 突變與NSCLC 患者使用酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）的療效密切相關(guān)以來(lái)，后續(xù)的多個(gè)大型臨床研究，包括IPASS、WJTOG3405、OPTIMAL、EURTAC、FASTACT-2、以及IMPRESS 等均從各個(gè)角度進(jìn)一步證實(shí)了EGFR 突變對(duì)于TKI 藥物的指導(dǎo)價(jià)值：突變陽(yáng)性患者的TKI 有效率高達(dá)70%以上，而總生存（OS）可以超過(guò)30 個(gè)月，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于單純使用化療藥物的時(shí)代。正因?yàn)槿绱?，EGFR的突變狀態(tài)已成為臨床醫(yī)生為NSCLC 患者制定治療方案的重要依據(jù)，美國(guó)國(guó)家癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）的NSCLC 臨床實(shí)踐指南（Version 4.2016）以及我國(guó)衛(wèi)計(jì)委發(fā)布的原發(fā)性肺癌診療規(guī)范（2015 年版）均已明確要求將EGFR 突變作為NSCLC 患者的必要檢測(cè)。

EGFR 突變檢測(cè)不得不遵循的幾個(gè)原則

        只有精準(zhǔn)的檢測(cè)結(jié)果才有可能精準(zhǔn)的指導(dǎo)患者治療，由于EGFR 突變檢測(cè)有一些自身的特點(diǎn)和要求，為保證其結(jié)果的可靠性，有幾個(gè)重要的原則必須要遵循：首先，EGFR 突變是一種體細(xì)胞的突變，與胚系突變所不同的是，這種突變不能遺傳后代，只發(fā)生于腫瘤細(xì)胞內(nèi)。因此，必須取到足量的腫瘤細(xì)胞或腫瘤來(lái)源的核酸才可以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確；其次，EGFR 突變檢測(cè)需要經(jīng)過(guò)PCR 擴(kuò)增，這是一個(gè)指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)的擴(kuò)增過(guò)程，一旦處理不當(dāng)，將會(huì)造成氣溶膠污染，影響檢測(cè)結(jié)果的可靠性。因此，除了采取必要的防污染措施之外，還需盡量選擇不用打開(kāi)反應(yīng)管的檢測(cè)方法；最后，檢測(cè)的樣品是具有異質(zhì)性的，發(fā)生突變的細(xì)胞或DNA 在檢測(cè)樣品中所占的含量一般很少，由于PCR 過(guò)程中會(huì)存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制，如何保證含量較少的突變DNA 能夠有效擴(kuò)增至可以檢測(cè)的范圍就顯得尤為重要。

EGFR 突變檢測(cè)方法探討

能夠取得足夠組織標(biāo)本的EGFR 檢測(cè)

        目前已知的EGFR 突變檢測(cè)方法有很多種，各種方法都有各自的優(yōu)勢(shì)和不足。總體來(lái)講，這些方法都可以相對(duì)人為的劃分為PCR 擴(kuò)增以及檢測(cè)擴(kuò)增效果兩個(gè)過(guò)程，而根據(jù)PCR擴(kuò)增的方式，可以將這些方法大致分為常規(guī)PCR 擴(kuò)增以及突變特異PCR 擴(kuò)增這兩類(lèi)。

        常規(guī)PCR檢測(cè)    采用常規(guī)PCR 的檢測(cè)方法包括直接測(cè)序法、焦磷酸測(cè)序法、變性高效液相色譜（dHPLC）法、高分辨率溶解曲線（HRM）法以及TaqMan 探

針?lè)ǖ鹊取＿@些方法命名的區(qū)別主要在于其檢測(cè)擴(kuò)增效果的方式所有不同，而對(duì)于擴(kuò)增過(guò)程來(lái)講，他們的共同點(diǎn)是對(duì)樣品中DNA 的突變類(lèi)型不會(huì)加以區(qū)分。由于野生型DNA 的擴(kuò)增不受任何限制，突變型DNA 的擴(kuò)增自然無(wú)法得到有效保證，這使得這些方法的靈敏度很難得到更進(jìn)一步的提升，一般在10%～20%之間。

        突變特異PCR檢測(cè)    與采用常規(guī)PCR 的檢測(cè)方法所不同的是，采用突變特異PCR 的檢測(cè)方法在PCR 擴(kuò)增的關(guān)鍵步驟中采用了一些特殊的措施，能夠保證樣品中的突變DNA 優(yōu)先得到有效擴(kuò)增。這些措施主要包括：① 將野生型和突變型DNA 分隔開(kāi)，分別進(jìn)行擴(kuò)增（數(shù)字PCR）；②消化樣品中的野生型DNA（突變富集PCR）；③抑制野生型DNA 解鏈（COLDPCR）；④ 阻止引物與野生型DNA 相結(jié)合等等。通過(guò)這些措施，可以使得檢測(cè)方法的敏感性得以大幅提升，達(dá)到1%甚至更高的水平，從而保證了檢測(cè)結(jié)果的可靠性?？傮w來(lái)講，綜合操作流程、污染幾率、敏感性、檢測(cè)價(jià)格、易實(shí)時(shí)性以及臨床實(shí)踐的證據(jù)等多個(gè)方面進(jìn)行整體衡量，ARMS 法無(wú)疑是其中最具優(yōu)勢(shì)的，也是目前推薦臨床使用的最佳手段，尤其是在腫瘤組織標(biāo)本的檢測(cè)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

不能取得足夠組織標(biāo)本的EGFR 檢測(cè)

        多數(shù)肺癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)就已處于晚期，很難能夠取到足夠的組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。為解決這一問(wèn)題，很多學(xué)者提出可以采用外周血中腫瘤來(lái)源的DNA（Circulatingtumor DNA，ctDNA）作為組織標(biāo)本的替代。但是，相比于腫瘤組織標(biāo)本，外周血中ctDNA 的含量是非常少的，因此對(duì)檢測(cè)方法的敏感性提出了更加苛刻的要求。目前可以滿足這種要求的主要有微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）以及二代測(cè)序這兩種方法。

        微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）    ddPCR 是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種新型數(shù)字PCR，其主要技術(shù)原理是將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成上萬(wàn)個(gè)納升級(jí)的微滴，其中每個(gè)微滴含有1個(gè)或數(shù)個(gè)待檢核酸靶分子。經(jīng)過(guò)PCR 擴(kuò)增之后，逐個(gè)對(duì)每個(gè)微滴的熒光擴(kuò)增信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)泊松分布原理以及陽(yáng)性微滴的個(gè)數(shù)與比例即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。由于操作簡(jiǎn)便，成本低廉，該技術(shù)在測(cè)低拷貝核酸標(biāo)本中的作用受到了越來(lái)越多的關(guān)注。解放軍3O7 醫(yī)院的研究團(tuán)隊(duì)與阿斯利康中國(guó)創(chuàng)新中心密切合作，已經(jīng)建立了檢測(cè)EGFR 突變的ddPCR 方法，對(duì)比組織學(xué)ARMS 法的檢測(cè)結(jié)果，該方法檢測(cè)外周血標(biāo)本的敏感性、特異性以及符合率分別可以達(dá)到83.3%、94%和89.5%， 最低的檢測(cè)下限可以達(dá)到0.04%，展示出了良好的臨床應(yīng)用前景。此外，ddPCR 還有一個(gè)重要的優(yōu)勢(shì)是可以對(duì)待檢DNA 進(jìn)行絕對(duì)定量，2014 年Oxnard 等人發(fā)表在Clin Cancer Res 雜志的研究證實(shí)，這種絕對(duì)定量的動(dòng)態(tài)變化與TKI 藥物的治療效果是密切相關(guān)的，這為患者療效的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)提供了可能。相信隨著未來(lái)更多臨床證據(jù)的出現(xiàn)，這項(xiàng)技術(shù)會(huì)為ctDNA 的EGFR 突變檢測(cè)提供更多的便利，更好的指導(dǎo)患者的精準(zhǔn)治療。

        二代測(cè)序    相比于傳統(tǒng)的直接測(cè)序，二代測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是可以同時(shí)對(duì)幾十甚至上萬(wàn)個(gè)基因進(jìn)行序列測(cè)定，而且通過(guò)增加測(cè)序的深度，其檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到0.01%的水平，完全可以滿足ctDNA 的檢測(cè)要求。與ddPCR 技術(shù)一樣，二代測(cè)序也可以對(duì)突變基因進(jìn)行定量分析，不過(guò)ddPCR 只能檢測(cè)已知突變，而二代測(cè)序?qū)σ阎臀粗蛔兙梢赃M(jìn)行分析，其應(yīng)用的領(lǐng)域更為廣闊。然而，對(duì)于EGFR 這樣的單個(gè)基因來(lái)說(shuō)，考慮到二代測(cè)序的技術(shù)門(mén)檻以及檢測(cè)成本都較高，采用該技術(shù)進(jìn)行突變檢測(cè)似乎有“殺雞焉用牛刀”之嫌。

        因此有學(xué)者提出，在臨床實(shí)踐過(guò)程中，ddPCR 和二代測(cè)序的聯(lián)合使用或許可以為患者的精準(zhǔn)治療提供更多的幫助。例如，對(duì)于剛剛確診的患者，可以先通過(guò)ddPCR 檢測(cè)EGFR 的突變狀態(tài)，陽(yáng)性的患者可以直接使用TKI 類(lèi)藥物；而對(duì)于ddPCR陰性的患者或者在陽(yáng)性患者出現(xiàn)耐藥的時(shí)間點(diǎn)上，可以通過(guò)二代測(cè)序檢測(cè)更多的候選基因，以尋找其他的藥物靶點(diǎn)或者分析患者的耐藥機(jī)制，從而保證患者能夠得到更為精準(zhǔn)的治療方案。

小結(jié)

        隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)理念的不斷普及，如何“在合適的時(shí)間，針對(duì)合適的患者，給予合適的治療”自然成為了大家普遍關(guān)注的話題。而作為精準(zhǔn)醫(yī)療的經(jīng)典實(shí)例，EGFR 突變從其發(fā)現(xiàn)到在臨床廣泛應(yīng)用的過(guò)程，給了我們很多深刻的啟示，使得我們對(duì)于腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制有了更多的認(rèn)識(shí)和了解。臨床診療的需求會(huì)不斷促進(jìn)檢測(cè)技術(shù)的更新和完善，而檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)化帶來(lái)的則是更為精準(zhǔn)的治療以及患者生存質(zhì)量的提高和生存期的延長(zhǎng)。相信在未來(lái)，EGFR 的這種模式一定可以拓展到其他癌種的更多驅(qū)動(dòng)基因，讓更多的患者能夠從中獲益。