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導(dǎo)讀
阿爾茨海默癥(AD)是一種以認(rèn)知功能障礙為特征的不可逆神經(jīng)退行性疾病。AD與年齡有著較大關(guān)聯(lián)，隨著全球平均壽命的增加，其癥狀日益嚴(yán)重。由于藥物細(xì)化的失敗，大量的研究致力于開發(fā)治療AD的策略。中藥作為一種潛在的治療AD方法正受到越來(lái)越多的關(guān)注。天麻、遠(yuǎn)志、肉蓯蓉、地黃、金錢蒲和姜黃(配比成GPCRAC)都是著名的中草藥，具有神經(jīng)保護(hù)作用。本研究建立東莨菪堿誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙小鼠模型以確定 GPCRAC 提取物在體內(nèi)的神經(jīng)保護(hù)作用；為了確定GPCRAC提取物改善AD的潛在分子機(jī)制，進(jìn)行了無(wú)標(biāo)簽定量蛋白質(zhì)組學(xué)與串聯(lián)質(zhì)譜 (LC-MS/MS) 相結(jié)合；應(yīng)用綜合生物信息學(xué)分析篩選重要經(jīng)典途徑中的核心差異表達(dá)蛋白；通過(guò) qPCR 和蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證了關(guān)鍵改變的蛋白質(zhì)。結(jié)果表明，GPCRAC提取物顯著恢復(fù)了東莨菪堿誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙，這可以通過(guò)改善學(xué)習(xí)和記憶能力、增加Ach含量和ChAT活性以及降低小鼠海馬中的AchE活性來(lái)證明。共有390個(gè)蛋白質(zhì)被鑒定為顯著差異表達(dá)蛋白，其中對(duì)照組和模型組之間顯著上調(diào)110個(gè)，顯著下調(diào)25個(gè)。通過(guò)映射顯著調(diào)控的蛋白質(zhì)，5個(gè)關(guān)鍵蛋白，PPP2CA、Gsk3β、PP3CC、PRKACA和BCL-2，被確定，它們分別與多巴胺能突觸和細(xì)胞凋亡信號(hào)通路相關(guān)。蛋白質(zhì)印跡和QPCR表明，這些核心蛋白的表達(dá)水平可以通過(guò)GPCRAC提取物處理顯著提高。GPCRAC提取物可有效緩解東莨菪堿誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙，這可能是通過(guò)調(diào)節(jié)多巴胺能突觸和細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。因此，從東莨菪堿處理的模型小鼠獲得的定量蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)成功地表征了AD相關(guān)的生物學(xué)改變，并提出了AD的新型蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物。
原名：Chinese HerbalExtracts Exert Neuroprotective Effect in Alzheimer’s Disease Mouse Through theDopaminergic Synapse/Apoptosis Signaling Pathway譯名：中草藥提取物通過(guò)多巴胺能突觸/凋亡信號(hào)通路對(duì)阿爾茨海默癥小鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用期刊：Frontiers in Pharmacology
1. GPCRAC提取物改善東莨菪堿誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶障礙為了評(píng)估GPCRAC提取物在體內(nèi)的神經(jīng)保護(hù)作用，我們建立了東莨菪堿誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙小鼠模型。采用新型物體識(shí)別(NOR)試驗(yàn)、跳臺(tái)回避(SDA)試驗(yàn)和Morris水迷宮(MWZ)試驗(yàn)評(píng)價(jià)GPCRAC提取物對(duì)東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的神經(jīng)保護(hù)作用（圖1）。在NOR試驗(yàn)中，東莨菪堿處理組（模型組）與對(duì)照組相比，在識(shí)別辨識(shí)指標(biāo)方面表現(xiàn)出低水平的特征，而GPCRAC提取物的中劑量組和高劑量組顯著改善了AD小鼠降低的RI（圖1A）。通過(guò)SDA測(cè)試，我們檢測(cè)到GPCRAC提取物以劑量依賴性方式顯著恢復(fù)了東莨菪堿誘導(dǎo)的較短跳臺(tái)潛伏期（圖1B），與模型組相比，高劑量組的GPCRAC提取物顯著減少了小鼠的錯(cuò)誤次數(shù)（圖1C）。在Morris水迷宮（MWZ）測(cè)試中，AD小鼠比對(duì)照組表現(xiàn)出學(xué)習(xí)和記憶障礙，而高劑量組的GPCRAC提取物改善了認(rèn)知障礙，這可以通過(guò)在移除平臺(tái)后的最后一天找到平臺(tái)位點(diǎn)的逃避潛伏期減少和平臺(tái)區(qū)域的更多穿越次數(shù)來(lái)證明（圖1D，E）。在探索期間，東莨菪堿處理的小鼠停留在目標(biāo)象限的時(shí)間減少（圖 1F）。此外，定位導(dǎo)航測(cè)試中記錄的逃避潛伏期顯示，AD 小鼠到達(dá)平臺(tái)所需的時(shí)間（逃避潛伏期）比對(duì)照組和GPCRAC提取物組長(zhǎng)，在第4天效果最為顯著（圖 1G），表明東莨菪堿暴露后顯著的空間學(xué)習(xí)和記憶障礙。圖1 GPCRAC提取物對(duì)東莨菪堿處理小鼠學(xué)習(xí)和記憶缺陷的改善作用新物體識(shí)別能力中新物體的探索時(shí)間百分比（辨識(shí)指標(biāo)RI）（A）；跳臺(tái)被動(dòng)回避測(cè)試中的延遲和錯(cuò)誤次數(shù)（B，C）；Morris水迷宮最后一天尋找隱藏平臺(tái)的逃避潛伏期(D)、穿越次數(shù)(E)、目標(biāo)象限停留時(shí)間(F)；定位導(dǎo)航測(cè)試中的逃避潛伏期（前四天連續(xù)訓(xùn)練）（G）。數(shù)據(jù)表示為平均值 ± SE (n = 17)。與對(duì)照組相比，*p < 0.05、**p < 0.01 和 ***p < 0.001；與東莨菪堿處理組相比，#p < 0.05、##p < 0.01和###p < 0.001。2. GPCRAC提取物改善東莨菪堿誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷乙酰膽堿(Ach)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)遞質(zhì)，在海馬記憶功能中起重要作用，并與AD的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)是一種合成乙酰膽堿(Ach)的酶，被認(rèn)為存在于腦脊液(CSF)和血漿中，而乙酰膽堿酯酶(AchE)是一種在突觸間隙代謝Ach的酶，可導(dǎo)致認(rèn)知障礙。為了進(jìn)一步評(píng)估GPCRAC提取物對(duì)海馬神經(jīng)元損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，我們?cè)u(píng)估了由Ach含量和ChAT活性降低以及AchE活性增加所表明的膽堿能功能障礙。如圖2所示，GPCRAC提取物顯著逆轉(zhuǎn)東莨菪堿處理小鼠海馬組織中Ach含量減少（圖2A）、ChAT活性降低（圖 2B）以及AchE活性增加（圖2C），尤其是高劑量組，證實(shí)了GPCRAC提取物在東莨菪堿暴露后對(duì)膽堿能功能的改善作用。結(jié)合行為實(shí)驗(yàn)，我們的研究結(jié)果表明，高劑量GPCRAC提取物有助于緩解東莨菪堿引起的認(rèn)知障礙，因此，我們選擇高劑量GPCRAC提取物進(jìn)行進(jìn)一步的機(jī)制研究。
圖2 GPCRAC提取物對(duì)東莨菪堿致認(rèn)知缺陷小鼠海馬膽堿能系統(tǒng)功能障礙的改善作用
根據(jù)試劑盒說(shuō)明書測(cè)定海馬Ach含量（A）、ChAT活性（B）和AchE活性（C）；數(shù)據(jù)表示為平均值±SE。與對(duì)照組相比，*p < 0.05、**p < 0.01和***p <0.001；與東莨菪堿處理組相比，#p < 0.05、##p < 0.01和###p < 0.001 (n=3)。3. 高效液相色譜分析鑒定了GPCRAC提取物的成分我們?cè)?/span>m/z 120-1800范圍內(nèi)記錄質(zhì)譜。所有數(shù)據(jù)均使用Xcalibur軟件（2.7 版）進(jìn)行處理。在優(yōu)化的 UHPLC 和 MS 條件下，主要成分得到了很好的分離和檢測(cè)（圖 3）。通過(guò)將UPLC-Q-Orbitrap MS分析與TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(https://old./tcmsp.php)和參考文獻(xiàn)進(jìn)行比較，我們鑒定了GPCRAC提取物的化學(xué)成分，采用正負(fù)離子模式的分子離子峰分析化合物的相對(duì)分子質(zhì)量；然后通過(guò)比較色譜保留時(shí)間和MS/MS信息對(duì)化合物進(jìn)行定性鑒定。最后，我們從GPCRAC提取物中鑒定出38種化合物，包括天麻素、SibiricoseA5、3,6'-Disinapolysucrose、OnjisaponinB、松果菊苷、毛蕊花糖苷、姜黃素、1',2'-二羥基細(xì)辛腦（表1）。
圖3 GPCRAC 提取物在正(A)和負(fù)(B)離子模式下監(jiān)測(cè)的總離子色譜圖
GPCRAC提取物成分分析：GPCRAC提取物有天麻素、3, 6'-Disinapoly sucrose、松果菊苷、毛蕊花糖苷、姜黃素等成分（C）。表1 UHPLC-Q-Orbitrap正負(fù)離子模式分析GPCRAC提取物的化學(xué)成分
4. 蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估我們使用從東莨菪堿誘導(dǎo)的AD小鼠獲得的海馬蛋白質(zhì)組的三個(gè)重復(fù)樣品進(jìn)行了高通量定量蛋白質(zhì)組學(xué)，基于非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)的流程圖如圖4A所示。詳細(xì)地，為了驗(yàn)證AD小鼠模型的海馬蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)是否可以應(yīng)用于進(jìn)一步的AD研究，我們?cè)u(píng)估了海馬蛋白質(zhì)組的定量重現(xiàn)性（技術(shù)和實(shí)驗(yàn)條件的差異）。每個(gè)樣本的標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)表達(dá)顯示出類似的分布（圖4B）。此外，我們應(yīng)用主成分分析(PCA)來(lái)表征海馬樣本內(nèi)和海馬樣本之間的蛋白質(zhì)組變化程度。如圖4C 所示，前兩個(gè)主成分（PC1 和 PC2）占總體累積方差貢獻(xiàn)率的87.9%。它還顯示了對(duì)照組和模型組之間明顯區(qū)分。此外，與模型組相比，來(lái)自GPCRAC提取物組的不同樣品位置更緊湊，表現(xiàn)出優(yōu)異的重現(xiàn)性。同樣，如圖4D所示，我們發(fā)現(xiàn)同一組的生物重復(fù)之間存在很強(qiáng)的Pearson相關(guān)性（R，0.990-1），并且不同組之間的相關(guān)性顯著降低?？傊?，觀察到的定量蛋白表達(dá)的變化反映了小鼠組織中不同組間分子變化的多樣性，而非由于我們的非標(biāo)記策略的影響。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)分析的工作流程穩(wěn)定可靠，無(wú)標(biāo)記定量 (LFQ) 技術(shù)提供的高定量準(zhǔn)確性使我們能夠研究AD病理發(fā)展中的蛋白質(zhì)組學(xué)改變。
圖4 蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估
基于LC-MS/MS的蛋白質(zhì)組學(xué)分析的工作流程的圖解說(shuō)明(A)；在每組三個(gè)重復(fù)樣品中檢測(cè)到的所有差異表達(dá)蛋白的Log2比率分布，由基于FDR <0.05 (B) 的ANOVA確定；從東莨菪堿誘導(dǎo)的AD小鼠(C)中獲得的海馬蛋白質(zhì)組的PCA分析。不同組之間的樣本相關(guān)熱圖（D）。為了表征蛋白質(zhì)譜中的差異表達(dá)，我們使用偏最小二乘判別分析 (PLS-DA) 模型進(jìn)一步優(yōu)化不同組的分離情況 (圖5A)。正交偏最小二乘判別分析 (OPLS-DA)是一種監(jiān)督識(shí)別方法，用于加強(qiáng)對(duì)照組與模型組（圖5B，R2Y = 0.941，Q2 = 0.685）和模型與GPCRAC之間的區(qū)分（圖5C，R2Y = 0.986，Q2 = 0.79）。隨后，我們使用置換檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估 OPLS-DA模型可能的過(guò)擬合。相應(yīng)的驗(yàn)證圖顯示，為不同組的重復(fù)樣本構(gòu)建的所有PLS-DA模型都是有效的（圖5D，E）。OPLS-DA分類結(jié)果顯示各組有明顯的分離，說(shuō)明不同組間差異表達(dá)蛋白的表達(dá)發(fā)生顯著變化。我們選擇MC/NC倍數(shù)變化> 1.2或<0.83和p < 0.05的蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步分析；對(duì)4,112種蛋白質(zhì)的子集進(jìn)行了定量（獨(dú)特肽 ≥ 2），其中390種定量蛋白質(zhì)被鑒定為差異表達(dá)蛋白。蛋白質(zhì)水平的變化如圖5F所示，具體來(lái)說(shuō)，對(duì)照組和模型組之間有135個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中110個(gè)是顯著上調(diào)的蛋白質(zhì)，25個(gè)是顯著下調(diào)的蛋白質(zhì)。并且，我們鑒定了受GPCRAC提取物調(diào)節(jié)的211種蛋白質(zhì)（128種上調(diào)和83種下調(diào)）。模型與對(duì)照和GPCRAC提取物與模型之間差異表達(dá)蛋白的重疊為9（圖5G）。
圖5 評(píng)估差異表達(dá)的蛋白質(zhì)
不同組樣本的PLS-DA得分圖（A）；OPLS-DA得分圖模型顯示對(duì)照組與模型(B)組和模型與GPCRAC提取物(C)組之間的明顯分離；對(duì)應(yīng)的置換檢驗(yàn)(D,E)；倍數(shù)變化截止值設(shè)置為 ≥ 1.2 或 ≤0.883，p < 0.05。從每組(F)中鑒定出海馬蛋白質(zhì)組學(xué)中上調(diào)或下調(diào)的蛋白質(zhì)；差異表達(dá)蛋白的維恩圖分析（G）。6. 綜合生物信息學(xué)分析提示GPCRAC提取物介導(dǎo)的治療AD的潛在靶點(diǎn)基于蛋白質(zhì)組學(xué)的綜合生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)GPCRAC提取物在AD治療中的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白。首先，通過(guò)GO和KEGG分析，我們探究GPCRAC提取物介導(dǎo)的AD治療中涉及的差異表達(dá)蛋白的潛在功能。基因本體(GO)生物學(xué)過(guò)程分析表明，這些差異表達(dá)蛋白主要富集于自噬小體、突觸前活性區(qū)膜、ATP酶激活物活性、突觸后電位、突觸后組裝的正向調(diào)控中，這與AD的病理學(xué)與海馬神經(jīng)元的突觸功能呈正相關(guān)的事實(shí)是一致的 (圖6A)。KEGG分析顯示相關(guān)通路，p < 0.05（圖6B）。我們?cè)?/span>KEGG通路分析中發(fā)現(xiàn)了剪接體、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、核糖體、多巴胺能突觸、長(zhǎng)期抑制、谷氨酸能突觸、GABA能突觸、細(xì)胞凋亡和其他高度富集項(xiàng)。我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)通路在調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)功能方面發(fā)揮重要作用，其中多巴胺能突觸通路是最佳的辨別神經(jīng)相關(guān)通路，表明多巴胺能通路可能是治療AD靶點(diǎn)富集的必要信號(hào)通路。此外，神經(jīng)元凋亡是AD退行性過(guò)程中一個(gè)眾所周知的通路。
圖6 差異表達(dá)蛋白的GO富集和KEGG通路分析
GO分析得出的差異表達(dá)蛋白的生物學(xué)過(guò)程（A）；差異表達(dá)蛋白的KEGG信號(hào)通路分析，p值設(shè)定為<0.05 (B)。接下來(lái)，為了確定GPCRAC提取物在治療AD中介導(dǎo)的核心蛋白靶點(diǎn)，我們構(gòu)建火山圖以檢測(cè)在對(duì)照組與模型（圖 7A）和模型與GPCRAC提取物（圖 7B）組之間顯著調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)。具體來(lái)說(shuō)，PPP2CA (p63330)、PRKACA (P05132)、PPP3CC (Q80XK0)、GSK3β (E9QAQ5) 和 BCL-2 (P10417) 被證實(shí)在模型與對(duì)照組中的蛋白質(zhì)譜明顯改變，但在GPCRAC提取物治療后顯著逆轉(zhuǎn)。為了評(píng)價(jià)這些與AD遺傳相關(guān)的顯著改變的蛋白質(zhì)的特定變化水平，我們研究了由單個(gè)樣本與合并樣本（稱為“標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)豐度”）的比率表示的“蛋白質(zhì)表達(dá)水平”。如圖7C所示，GSK3β、PPP2CA、PRKACA、PPP3CC 和 BCL-2 的表達(dá)水平與火山圖一致，在GPCRAC提取物處理后恢復(fù)。在這些關(guān)鍵蛋白中，PPP2CA 和 PRKACA在AD組中下調(diào)，GSK3β、PPP3CC和BCL-2在AD組中上調(diào)。之后，我們利用Pearson的相關(guān)熱圖來(lái)解釋核心差異蛋白之間相互作用的“跡象”（即激活-抑制關(guān)系）。相關(guān)矩陣數(shù)據(jù)（圖 7D）顯示這些核心調(diào)節(jié)蛋白之間呈正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，PPP3CC和 PRKACA與BCL-2呈正相關(guān)，而 PPP2CA和GSK3β 呈負(fù)相關(guān)。
圖7 關(guān)鍵顯著調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的映射
火山圖顯示了對(duì)照組與模型(A)組和模型與GPCRAC提取物(B)組之間顯著改變的蛋白質(zhì)分布；五種蛋白質(zhì)（PPP2CA、GSK3β、PPP3CC、PRKACA和BCL-2）被鑒定為AD小鼠海馬關(guān)鍵差異表達(dá)蛋白。蛋白質(zhì)的強(qiáng)度作為歸一化的蛋白質(zhì)豐度給出。箱形圖 (C) 中顯示了五種蛋白質(zhì)的顯著變化水平；關(guān)鍵差異表達(dá)蛋白的相關(guān)系數(shù)熱圖（D）。接下來(lái)，我們?cè)噲D進(jìn)一步證明核心網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵蛋白的生物學(xué)解釋。簡(jiǎn)而言之，我們使用Cytoscape的Cytohubba插件進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 (PPI) 網(wǎng)絡(luò)來(lái)表征核心網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)變化。前35個(gè)節(jié)點(diǎn)首先使用最大團(tuán)中心性(MCC)方法進(jìn)行排名。關(guān)鍵蛋白及其生物學(xué)功能最終被發(fā)現(xiàn)。PPI可視化結(jié)果表明，幾種改變的蛋白質(zhì)相互之間存在顯著聯(lián)系（富集值p < 0.005），并且大多數(shù)關(guān)鍵差異蛋白主要集中在多巴胺能突觸和細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中，此外，這些途徑和一些已確定的核心蛋白與AD發(fā)病機(jī)制有關(guān)（圖8）。我們最終選擇與多巴胺能突觸相關(guān)的PP2CA、PRKACA、PPP3CC、GSK3β和BCL-2作為進(jìn)一步的分析目標(biāo)，因?yàn)樗鼈兣c神經(jīng)元損傷密切相關(guān)。
圖8 構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型以闡明核心網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵蛋白的生物學(xué)解釋
構(gòu)建了對(duì)照組和模型組之間 135 種蛋白質(zhì)的功能性蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 (PPI) 網(wǎng)絡(luò)。MCC排名前 35 的節(jié)點(diǎn)。節(jié)點(diǎn)填充顏色條表示上調(diào)（紅色）或下調(diào)（綠色）。節(jié)點(diǎn)文本顏色條代表 p 值。7. 蛋白質(zhì)靶標(biāo)的驗(yàn)證我們通過(guò)蛋白質(zhì)印跡和qPCR進(jìn)一步驗(yàn)證了GPCRAC提取物在介導(dǎo)AD中的關(guān)鍵差異表達(dá)蛋白和途徑。PPP2CA 編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶 2A (PP2A) 催化亞基的α (α)-亞型。PP2A和GSK3β是參與多巴胺能突觸通路中突觸可塑性調(diào)節(jié)的必需蛋白，它們與AD中的異常tau磷酸化和神經(jīng)元死亡有關(guān)。此外，PPP3CC和PRKACA也是突觸和神經(jīng)可塑性的重要調(diào)節(jié)劑，圖9說(shuō)明了這一點(diǎn)。代表性蛋白質(zhì)印跡圖像（圖 9A-E）和PPP2CA、P-PKA、PPP3CC、P-GSK3β、BCL-2和Bax的相對(duì)光密度值的倍數(shù)變化通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)定。在暴露于東莨菪堿的小鼠海馬中，與對(duì)照組相比， PPP2CA、P-PKA、PPP3CC的表達(dá)減少（圖 9F、G、J），和P-GSK3β 表達(dá)過(guò)度激活（圖9I）（p = 0.005）。高劑量的GPCRAC提取物導(dǎo)致PPP2CA、PPP3CC、P-PKA和P-GSK3β的表達(dá)水平發(fā)生相當(dāng)大的逆轉(zhuǎn)。我們還發(fā)現(xiàn)東莨菪堿處理的模型小鼠相對(duì)于對(duì)照組，其PPP2CA和PPP3CC的mRNA表達(dá)水平較低（圖 9L，N），GPCRAC提取物處理后恢復(fù)。
圖9 RT-qPCR 和WB驗(yàn)證了顯著變化的蛋白質(zhì)
通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分別測(cè)量小鼠海馬組織中 PPP2CA、GSK3β、PRKACA、PPP3CC、BCL-2、Bax 的代表性圖像 (A-E) 和蛋白質(zhì)水平 (n = 3) (F-K)；real time-PCR分別檢測(cè)海馬組織中PPP2CA、PPP3CC和Caspase-3的mRNA相對(duì)表達(dá)量（n=3）（L-N）；數(shù)據(jù)表示為平均值±SE，與對(duì)照組相比，*p < 0.05、**p < 0.01和***p < 0.001；與東莨菪堿治療組相比，#p < 0.05、##p < 0.01和###p < 0.001 (n= 3)。細(xì)胞凋亡信號(hào)系統(tǒng)是動(dòng)物生長(zhǎng)和組織穩(wěn)態(tài)的重要途徑。我們使用蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)了凋亡相關(guān)蛋白 BCL-2 的明顯改變，因此我們想了解更多關(guān)于東莨菪堿處理小鼠海馬細(xì)胞凋亡水平和GPCRAC提取物的保護(hù)作用的信息。此外，qPCR 和蛋白質(zhì)印跡用于研究 GPCRAC 提取物在東莨菪堿處理的小鼠海馬中的抗凋亡功效。與對(duì)照動(dòng)物相比，Bax 蛋白表達(dá)水平（圖 9K）和 Caspase-3 基因表達(dá)水平（圖 9M）明顯較高，BCL-2 蛋白水平較低（圖 9H）。在小鼠大腦中，GPCRAC 提取物處理可顯著降低 Bax 和 Caspase-3 的表達(dá)，同時(shí)增加 BCL-2 的表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)表明，GPCRAC 提取物可顯著調(diào)節(jié)東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠腦組織中多巴胺能突觸相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而治療AD。
圖10 GPCRAC提取物對(duì)AD的多巴胺能突觸信號(hào)通路的調(diào)控
由 GPCRAC 提取物介導(dǎo)的核心差異表達(dá)蛋白以紅色（上調(diào)）和綠色（下調(diào)）著色。使用中藥作為AD的潛在治療方法是一個(gè)不斷發(fā)展的研究領(lǐng)域。然而，目前中藥治療缺乏有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)和機(jī)制闡述。一些更有效的療法也正在被開發(fā)。在這項(xiàng)工作中，我們首先研究了GPCRAC提取物在減少東莨菪堿誘發(fā)的認(rèn)知障礙方面的神經(jīng)保護(hù)作用。東莨菪堿是一種毒蕈堿膽堿能受體拮抗劑，經(jīng)常被用作在動(dòng)物中產(chǎn)生認(rèn)知障礙的經(jīng)典藥理學(xué)模型。據(jù)報(bào)道，東莨菪堿活性主要與大腦中的膽堿能耗竭和細(xì)胞凋亡有關(guān)，這兩者都是該疾病的標(biāo)志?；跂|莨菪堿誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙，我們研究了AD模型小鼠的行為表型，發(fā)現(xiàn)高劑量的GPCRAC提取物顯著緩解AD相關(guān)的膽堿能功能障礙，表現(xiàn)為Ach含量和ChAT活性增加以及AchE 活性降低。此外，行為測(cè)試表明，東莨菪堿觸發(fā)的小鼠海馬體在空間學(xué)習(xí)和記憶能力方面表現(xiàn)出認(rèn)知功能障礙。除了研究 GPCRAC 提取物在改善認(rèn)知障礙方面的保護(hù)功效外，之前我們還進(jìn)行了急性口服毒性和13周亞急性毒性研究。臨床觀察、體重、血液學(xué)、組織病理學(xué)檢查、眼科檢查等安全性評(píng)價(jià)均未見(jiàn)不良變化。結(jié)合之前的結(jié)果，目前的研究證明 GPCRAC 提取物的給藥既有效又安全。目前，雖然已有多個(gè)信號(hào)通路在AD治療中發(fā)揮顯著作用，但中藥對(duì)AD病理過(guò)程中潛在信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用仍有待研究。天然草藥由于其成分復(fù)雜，尤其是化合物，通常更難在特定途徑中得到闡明。為了進(jìn)一步了解 GPCRAC 提取物緩解 AD 的作用機(jī)制，我們采用深入的定量蛋白質(zhì)組學(xué)來(lái)表征從東莨菪堿誘導(dǎo)的AD小鼠獲得的海馬蛋白質(zhì)組的異常變化。我們基于MS的策略確定了不同組共同的390種蛋白質(zhì)。通過(guò)映射顯著調(diào)控的蛋白質(zhì)圖譜，我們確定了五種關(guān)鍵蛋白：PPP2CA、GSK3β、PPP3CC、PRKACA、BCL-2。顯著改變的蛋白分別在多巴胺能突觸信號(hào)通路和凋亡信號(hào)通路中富集。因此，這些關(guān)鍵蛋白和相關(guān)通路或許作為治療 AD 的可能機(jī)制。作為AD重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，多巴胺能突觸信號(hào)通路在神經(jīng)遞質(zhì)協(xié)調(diào)、記憶鞏固、神經(jīng)元突觸功能等過(guò)程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。蛋白磷酸酶 2A (PP2A)在大腦中濃度較高，是一種至關(guān)重要的磷酸酶。且PP2A上調(diào)與tau過(guò)度磷酸化和淀粉樣蛋白形成的減少有關(guān)，最近的證據(jù)表明，PP2A介導(dǎo)的蛋白質(zhì)去磷酸化對(duì)于突觸可塑性的穩(wěn)態(tài)很重要。GSK3β是一種激酶，在AD的病因中發(fā)揮作用，它在被上游蛋白質(zhì)如PP2A去磷酸化(p-GSK3β)后發(fā)揮生物學(xué)功能。此外，GSK3β可以通過(guò)調(diào)節(jié)D2受體(D2R)介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)改善多巴胺依賴性記憶行為，被推測(cè)為AD的潛在治療靶點(diǎn)，這支持了其與多巴胺能突觸途徑的關(guān)聯(lián)。此外，GSK3β和PP2A之間的相互作用已經(jīng)確立，即主要磷酸酶PP2A可以通過(guò)去除絲氨酸9位的磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)GSK3β的活性。我們的蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)一步佐證了PP2A和GSK3β之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，這對(duì)于基礎(chǔ)突觸傳遞和長(zhǎng)期記憶功能都至關(guān)重要。與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致，我們的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)模型組海馬PP2A表達(dá)減少，磷酸化GSK3β（p-GSK3β）增加，這進(jìn)一步支持PP2A和GSK3β平衡的假設(shè)，即協(xié)調(diào)突觸可塑性功能，可能是AD治療的重要分子機(jī)制。此外，cAMP 介導(dǎo)的蛋白激酶 A (PKA，對(duì)應(yīng)于基因符號(hào)PRKACA)的激活是多巴胺能突觸通路的經(jīng)典下游靶點(diǎn)，在突觸前長(zhǎng)期可塑性的激活過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。根據(jù)我們蛋白質(zhì)組學(xué)和蛋白質(zhì)印跡分析的發(fā)現(xiàn)，磷酸化 PKA (P-PKA) 可能是GPCRAC提取物治療AD的關(guān)鍵靶點(diǎn)。此外，絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶 (PPP3CC) 編碼鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 (CaN；也稱為蛋白磷酸酶 2B，PP2B) 的催化亞基，也是我們篩選的差異表達(dá)蛋白中涉及的新指標(biāo)。結(jié)果表明，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶可以通過(guò)間接影響對(duì)神經(jīng)元通訊至關(guān)重要的NMDAR來(lái)調(diào)節(jié)谷氨酸傳遞，而NMDAR的增加可能與PPP3CC水平的增加有關(guān)。根據(jù)我們的蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果，模型組中PPP3CC蛋白表達(dá)上調(diào)。然而，利用蛋白質(zhì)印跡和qPCR驗(yàn)證，在AD小鼠海馬中發(fā)現(xiàn)PPP3CC蛋白和基因表達(dá)水平下降，這與Eastwood等人的早期發(fā)現(xiàn)相當(dāng)。他們還發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)病理?xiàng)l件下，海馬神經(jīng)元中 PPP3CCmRNA 的表達(dá)水平較低，這表明這種表達(dá)的降低可能導(dǎo)致突觸可塑性衰竭。我們的發(fā)現(xiàn)增加了PPP3CC水平隨著AD的病理進(jìn)展而降低的證據(jù)，并強(qiáng)調(diào)了PPP3CC可能作為AD的新型蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的重要作用。然而，PPP3CC在AD中的作用之前尚未被完全描述，其預(yù)防神經(jīng)損傷的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。總體而言，GPCRAC 提取物可通過(guò)調(diào)節(jié)多巴胺能突觸信號(hào)通路來(lái)緩解認(rèn)知障礙（圖 10）。除了多巴胺能突觸通路相關(guān)蛋白外，凋亡通路相關(guān)蛋白 BCL-2 顯示出顯著改變的特征。研究表明多巴胺缺乏介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡是神經(jīng)退行性疾病的重要病理基礎(chǔ)，有人提出膽堿能缺陷引起的神經(jīng)元凋亡可能是東莨菪堿誘導(dǎo)的認(rèn)知能力下降的主要原因之一。細(xì)胞存活或死亡級(jí)聯(lián)可以通過(guò)增加抗凋亡蛋白 BCL-2 來(lái)啟動(dòng)。此處變化數(shù)據(jù)表明，東莨菪堿處理組中 BCL-2 表達(dá)顯著上調(diào)，這與蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果相矛盾。這種矛盾的發(fā)現(xiàn)可能歸因于樣本和處理的差異。此外，GPCRAC 提取物處理后，Bax 和 capease3 濃度也有很大的正向差異。綜上所述，上述結(jié)果支持GPCRAC提取物對(duì)AD的神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過(guò)生物信息學(xué)分析推斷出的多巴胺能突觸級(jí)聯(lián)和凋亡通路。總的來(lái)說(shuō)，我們的工作為AD病理過(guò)程中突觸可塑性改變的分子機(jī)制提供了新的見(jiàn)解，并進(jìn)一步證實(shí)了GPCRAC提取物作為一種天然草藥方劑改善進(jìn)行性AD的有效性。然而，由 GPCRAC提取物介導(dǎo)的詳細(xì)分子機(jī)制主要是未知的，值得進(jìn)一步研究?？傊?，我們的研究結(jié)果表明，GPCRAC提取物治療可以有效緩解東莨菪堿引起的認(rèn)知障礙。潛在機(jī)制可能與多巴胺能突觸/凋亡通路的調(diào)節(jié)有關(guān)。https://pubmed.ncbi.nlm./35295332/
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