mRNA疫苗是將外源靶抗原的基因序列通過轉(zhuǎn)錄、合成等工藝制備的mRNA通過特定的遞送系統(tǒng)導入機體細胞，通過在體內(nèi)表達目的蛋白，刺激機體產(chǎn)生特異性免疫學反應，從而使機體獲得免疫保護的一種核酸制劑。mRNA疫苗作為一種平臺型技術，在設計和構(gòu)建上具有快速性、應變性以及簡單的全合成制備等優(yōu)勢，新型冠狀病毒肺炎在全球范圍爆發(fā)和蔓延后，隨著Moderna和BioNtech公司的mRNA疫苗在臨床上的安全性和保護效力得到進一步驗證，使得mRNA疫苗技術得到廣泛關注并推動了其快速發(fā)展。相比于其他類型的疫苗來講，mRNA疫苗藥學研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控等涉及諸多特殊的考慮因素，上游研究主要針對mRNA序列的設計和修飾、遞送系統(tǒng)的選擇和開發(fā)等方面，下游集中于mRNA疫苗的生產(chǎn)工藝的優(yōu)化和高效大規(guī)模生產(chǎn)系統(tǒng)的建立。mRNA疫苗開發(fā)的關鍵技術流程如下：

一、模板設計、轉(zhuǎn)錄模板質(zhì)粒構(gòu)建和菌種庫

（一）藥物靶點的選擇和DNA模板設計

通過病毒的分離鑒定、免疫原性和生物學功能研究或基因組測序和新生抗原預測技術等，明確目的抗原的氨基酸和基因序列及蛋白結(jié)構(gòu)等信息，驗證其在預防病毒傳播或疾病控制中的作用，篩選出抗原靶標。

為了提高mRNA的穩(wěn)定性，增加目的蛋白在體內(nèi)的翻譯效率，降低mRNA的先天性免疫水平。需要在DNA轉(zhuǎn)錄模板水平上對體外轉(zhuǎn)錄的mRNA序列進行設計和優(yōu)化，mRNA的主要功能元件和優(yōu)化策略見圖1，主要包括ORF區(qū)密碼子、GC含量優(yōu)化，修飾、序列改構(gòu)（如引入信號肽、額外插入有利于蛋白多聚體形成的核苷酸序列等）。轉(zhuǎn)錄mRNA的功能性元件：帽子結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄啟動子、5’UTR和3’UTR、Poly(A)加尾長度的設計，對所用核苷三磷酸（NTP）類型（如將尿嘧啶修改成為1-甲基-假尿苷（1mΨ））及其修飾信息等進行設計。其中5’帽子可以保護mRNA免受核酸外切酶的影響，是翻譯起始復合體eIF4F的結(jié)合位點，5’UTR和3’UTR以及polyA 尾的長度影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯的效率。核苷的修飾不僅可以增強RNA的穩(wěn)定性，還可降低RNA的先天免疫反應。

圖1. 體外轉(zhuǎn)率mRNA的主要功能元件和主要優(yōu)化策略

（二）轉(zhuǎn)錄模板質(zhì)粒的構(gòu)建

通過化學合成，PCR擴增獲得設計后的抗原DNA序列，然后將其和質(zhì)粒載體DNA進行相應的切割后，將二者連接完成用于RNA疫苗生產(chǎn)的重組質(zhì)粒構(gòu)建。

（三）種子庫的建立和檢定

將合格的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌工程菌，經(jīng)克隆篩選后建立種子庫系統(tǒng)（主菌種庫和工作菌種庫）。為保證種子庫無外源因子污染及目的基因序列和其他元件的準確性，對種子庫進行全面檢定，包括革蘭氏染色、生化試驗、16S rRNA測序、抗生素抗性檢測、外源噬菌體檢測、質(zhì)粒酶切分析等。并開展種子庫遺傳穩(wěn)定性分析，以明確各級種子庫的限定傳代代次。

二、原液與制劑的生產(chǎn)和質(zhì)量控質(zhì)

（一）mRNA原液生產(chǎn)與質(zhì)控

mRNA原液生產(chǎn)一般分為兩個階段：

（1）制備DNA轉(zhuǎn)錄模板

轉(zhuǎn)錄模板制備一般通常通過大腸桿菌發(fā)酵來擴增DNA、DNA純化、質(zhì)粒DNA的線性化等流程獲得。此階段關鍵的質(zhì)控項目包括序列準確性、線性化率、模板濃度、純度、雜質(zhì)殘留、內(nèi)毒素等。

mRNA測序準確性不如DNA測序且受限于其轉(zhuǎn)錄長度，因此對轉(zhuǎn)錄模板DNA測序是確保轉(zhuǎn)錄出正確序列mRNA的前提。毛細管電泳可對不同類型DNA（超螺旋、環(huán)狀、線性）進行較好的區(qū)分，常用于模板DNA的線性化率的檢測。

轉(zhuǎn)錄模板中的雜質(zhì)（如質(zhì)粒DNA抽提過程中殘留的宿主菌DNA、宿主菌RNA、宿主蛋白、RnaseA）會顯著影響體外轉(zhuǎn)錄反應和轉(zhuǎn)錄mRNA的質(zhì)量，需對模板的純度進行嚴格的質(zhì)控。宿主菌蛋白殘留一般用熒光染色法進行檢測，殘留宿主DNA的檢測?；诙?PCR (qPCR)的方法。

（2）體外轉(zhuǎn)錄（In Vitro Transcription，IVT）制備mRNA

mRNA制備通常包括以DNA為轉(zhuǎn)錄模板進行mRNA體外轉(zhuǎn)錄、mRNA加帽、去磷酸化、DNA酶處理、mRNA純化等步驟。其中加帽可在轉(zhuǎn)錄過程中進行，也可作為單獨的步驟在轉(zhuǎn)錄后進行；mRNA核苷酸修飾、加Poly(A)尾通常在轉(zhuǎn)錄過程中進行。此過程需要的主要輔料包括核苷酸和修飾核苷酸、5’-帽類似物、用于mRNA體外合成大量使用的各種酶（如T7轉(zhuǎn)錄酶、加帽反應過程中添加的酶等）和緩沖液、純化介質(zhì)（層析柱、磁珠、過濾膜）及溶劑等。針對此步驟，賽默飛除可提供研發(fā)端的各種體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（MEGAscript? T7、mMESSAGE mMACHINE? T7、mMESSAGE mMACHINE? T7 ULTRA 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒）以外，還可提供適用于工業(yè)級規(guī)?；a(chǎn)的TheraPure試劑：包括用于體外轉(zhuǎn)錄的T7 RNA聚合酶、RNA酶抑制劑、無機焦磷酸酶、核苷酸和修飾核苷酸；加帽酶、2’-O-甲基轉(zhuǎn)移酶、定制化學帽類似物或ARCA抗反向帽類似物、Poly(A)聚合酶；用于模板DNA和蛋白去除的DNase I、蛋白酶K等；所有試劑均具有超高純度且不含動物源成分，均受監(jiān)管支持且已經(jīng)成功應用于核酸治療。

IVT過程中雜質(zhì)的污染會極大地影響mRNA疫苗的安全性和效力，被引入人體細胞的雙鏈RNA和DNA-RNA雜交分子等能被細胞模式識別受體識別觸發(fā)先天免疫反應，誘導I型干擾素的表達，降低蛋白質(zhì)的翻譯。因此對mRNA純化步驟至關重要，目前新冠疫苗生產(chǎn)工藝中采用Oligo dT柱、LiCl沉淀法、硅膠柱等多種純化技術對體外合成的mRNA中污染物進行去除。mRNA的純化工藝主要包括切向流過濾TFF和層析工藝。首先，使用TFF裝置對樣品進行純化、濃縮及緩沖液置換。接下來，使用層析填料進一步純化。以Oligo dT柱層析為例，賽默飛生物工藝的POROS Oligo (dT)25由脫氧胸腺嘧啶(dT-25) 配體組成，通過特有的linker連接到50μm POROS基質(zhì)上，dT-25配體通過 AT 堿基配對與帶有polyA 的 mRNA 分子結(jié)合，可以特異性親和捕獲mRNA的polyA尾巴，在中性或高鹽條件上樣，低鹽或純水洗脫，收率能夠達到90%以上的水平。

圖2 POROS Oligo(dT)25親和填料

mRNA原液的質(zhì)控項目包括mRNA含量、純度、產(chǎn)品相關雜質(zhì)（如不完整mRNA、雙鏈RNA等）、工藝相關雜質(zhì)（如微球殘留、蛋白酶殘留、DNA模板、有機溶劑、金屬離子）等。還包括mRNA的核酸序列正確性、加帽率、PolyA尾長度等結(jié)構(gòu)相關的質(zhì)控項目。

RNA含量一般用紫外分光光度法進行檢測，序列正確性可通過Sanger測序進行確認。加帽率、PolyA長度以及修飾核苷酸檢測一般采用質(zhì)譜法，是mRNA質(zhì)控的重點和難點。賽默飛的Orbitrap高分辨質(zhì)譜核酸分析平臺，可以實現(xiàn)mRNA加帽效率、ployA尾分析、mRNA mapping、雜質(zhì)鑒定及定量等功能，為疫苗開發(fā)和質(zhì)控提供更精確可靠的數(shù)據(jù)。

圖3 Orbitrap 高分辯質(zhì)譜核酸分析平臺

案例分享

編碼新冠突刺蛋白的mRNA (3900nt)樣品分析，首先用反相離子對色譜檢測mRNA樣品純度，如下圖a所示。采用上述mRNA mapping分析平臺，從前處理到液質(zhì)表征分析，得到如下結(jié)果：圖b顯示mRNA樣品經(jīng)過RNase T1酶解后的總離子流圖，由于部分酶解，得到的片段較長，具有高特異性；對于長度3900nt的mRNA樣品，在該分析流程下，僅用RNase T1酶，即可獲得98.5%序列覆蓋度結(jié)果。

（二）制劑的生產(chǎn)與質(zhì)控

脂質(zhì)納米顆粒（LNP）是現(xiàn)階段mRNA疫苗采用的主要遞送體系，其直徑100納米左右，成分包括中性脂質(zhì)、陽離子脂質(zhì)、膽固醇、PEG-脂質(zhì)?？梢杂行ж撦dmRNA分子，保護mRNA分子免受酶促降解，提高mRNA分子的內(nèi)化效率。mRNA包封/裝載的過程一般系以聚陽離子材料或正電荷脂質(zhì)等材料與mRNA復合（complexing）后直接成粒，或成粒后再經(jīng)包覆形成核殼形結(jié)構(gòu)的過程。還包括后續(xù)純化步驟，以去除未包封/裝載的mRNA、游離的聚合物或脂質(zhì)材料。

制備遞送物質(zhì)及其與mRNA的復合、顆粒成型等系mRNA疫苗的關鍵工藝步驟。目前工業(yè)放大工藝多數(shù)采用微流控混合技術來制備LNP，將脂質(zhì)與核酸分別溶解在水相和有機相后，將兩相溶液注入制備系統(tǒng)的兩條入口通道，一端是RNA的水溶液，一端是脂質(zhì)的乙醇溶液，通過兩相的快速混合，完成核酸脂質(zhì)納米顆粒的合成。改變流體注入速度和比率，可以控制脂質(zhì)納米顆粒的粒徑大小。

對LNP的質(zhì)控重點項目有：復合率和/或包封率、pH、平均粒徑及粒徑分布、粒子微觀形態(tài)、Zeta電位、滲漏/釋放的評價等。

針對LNP的一些質(zhì)控項目和方法

LNP的粒徑分布以及Zeta電位可通過配套的粒度分析儀進行檢測。核酸濃度、mRNA包封率項目可以通過A260法或熒光分析法進行檢測。冷凍電鏡可以在不破壞納米粒子的結(jié)構(gòu)前提下對LNP的形態(tài)進行觀察，是常用一種對LNP形貌進行表征的手段。高效液相色譜法（HPLC，Thermo Scientific? Dionex? ICS-6000 HPLC? 系統(tǒng)）是一種有效質(zhì)量控制的手段，可對LNP各組分如膽固醇、PEG的鑒定和含量則用進行分析。

新冠肆虐2年，此起彼伏，唯有預防和治療齊頭并進，才能適當抑制疫情。相較于傳統(tǒng)疫苗，我們看到了mRNA疫苗的諸多優(yōu)勢，它潛力無限。賽默飛作為科學服務領域的領導者，從mRNA藥物研發(fā)到大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)，可以提供完整的解決方案，全線賦能生物制藥創(chuàng)新之旅。

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