環(huán)狀RNA（circRNA）是一種新興的內(nèi)源性非編碼RNA（ncRNA），它們參與細(xì)胞增殖、粘附、凋亡和存活等多個(gè)生物學(xué)過程[1]。

近年來，circRNAs在腫瘤領(lǐng)域也獲得了越來越多的關(guān)注。有研究表明許多circRNA能促進(jìn)細(xì)胞周期發(fā)展，抑制或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡以及抑制血管生成等等[2]，各種不同的circRNAs在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著不同甚至相反的作用。

雖然越來越多的研究報(bào)道了乳腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌中異常的circRNAs[3]，但circRNAs在腫瘤細(xì)胞中的生物學(xué)功能、分子機(jī)制和環(huán)狀模式尚不清楚。此外，還有研究提出circRNAs可以通過病理功能未知的外泌體分泌到循環(huán)中[4]，且比線性RNAs更容易被分選進(jìn)入外泌體。然而，circRNAs的外泌體特異性分選機(jī)制也仍然完全未知。

近日，來自浙江大學(xué)張紅河和中國(guó)藥科大學(xué)來茂德領(lǐng)銜的研究團(tuán)隊(duì)，闡明了circRHOBTB3在結(jié)直腸癌（CRC）進(jìn)展中的生物學(xué)作用、環(huán)化過程和分泌途徑，這一結(jié)果發(fā)表在Molecular Cancer期刊上。

他們發(fā)現(xiàn)，抑瘤circRHOBTB3通過外泌體被癌細(xì)胞排出，以維持結(jié)直腸癌細(xì)胞的活性。此外，他們還設(shè)計(jì)了靶向circRHOBTB3的環(huán)狀化和分泌元件的反義寡核苷酸（ASOs），用于CRC的治療。

論文首頁(yè)截圖

circRHOBTB3是宿主基因RHOBTB3轉(zhuǎn)錄后剪接和環(huán)狀化而產(chǎn)生的一種circRNA。RHOBTB3作為Rho GTPase家族ATP酶，參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)[5、6]和蛋白酶體降解[7]。

先前的研究也表明circRHOBTB3在CRC、卵巢癌、胃癌和肝細(xì)胞癌（HCC）中作為腫瘤抑制circRNA。然而，它的循環(huán)模式和外泌體分泌途徑并未被闡釋。

首先，研究人員分析了來自GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的12例CRC患者、21例HCC患者、32例胰腺腺癌（PAAD）患者和14例健康供體的血清外泌體的總RNA-seq數(shù)據(jù)。

結(jié)果顯示，許多circRNAs在腫瘤患者血清外泌體中的表達(dá)程度不同（圖1A），但在所有三種癌癥來源的外泌體中，只有hsa_circ_0007444（circRHOBTB3）均表達(dá)上調(diào)（圖1B），且其宿主基因RHOBTB3在三種腫瘤組織中的表達(dá)與正常組織相比均無(wú)顯著性的增強(qiáng)（圖1C）。

圖1 不同類型癌癥中ircRHOBTB3在患者血清外泌體中的表達(dá)情況

然而，對(duì)來自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院邵逸夫醫(yī)院體檢的18例CRC患者和16例健康供者的血清樣本數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，與健康供者相比，circRHOBTB3在CRC組織中顯著下調(diào)，而宿主基因RHOBTB3顯著上調(diào)（圖2左二）。而且，在69個(gè)CRC組織樣本中檢測(cè)到的circRHOBTB3的表達(dá)結(jié)果顯示，circRHOBTB3水平較高患者的總生存期更好（圖2右一）。

圖2  ircRHOBTB3在CRC組織中患者血清外泌體中的表達(dá)情況

于是，研究者不禁假設(shè)，circRHOBTB3是否具有抑癌作用？

為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，他們先確定了CRC患者血清外泌體中的circRHOBTB3確實(shí)來源于腫瘤細(xì)胞而非基質(zhì)細(xì)胞（圖3A），且circRHOBTB3水平在來自NCM460細(xì)胞（正常的腸上皮細(xì)胞系）的外泌體中最低（圖3B）。進(jìn)一步在RKO、HCT116細(xì)胞（CRC細(xì)胞系）中過表達(dá)或敲低circRHOBTB3，結(jié)果表明circRHOBTB3可以抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力（圖3C）。

圖3  circRHOBTB3來源與功能的體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

并且，他們通過對(duì)circRHOBTB3敲除/重新表達(dá)細(xì)胞系RNA-Seq數(shù)據(jù)的分析，以及RT-qPCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，在circRHOBTB3敲除的細(xì)胞系中代謝、增殖和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）通路相關(guān)基因顯著上調(diào)，而circRHOBTB3的重新表達(dá)降低了這些基因的表達(dá)。此外，circRHOBTB3敲除的細(xì)胞系中ROS水平也顯著升高。

他們還發(fā)現(xiàn)circRHOBTB3的結(jié)合蛋白是ENO1和ENO2。也就是說，circRHOBTB3可能通過與ENO1和ENO2等代謝酶相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和EMT。

為了驗(yàn)證circRHOBTB3在體內(nèi)的功能，研究人員將過表達(dá)circRHOBTB3的HCT116細(xì)胞（CRC細(xì)胞系）皮下注射到裸鼠體內(nèi)，構(gòu)建了異種移植瘤模型。研究發(fā)現(xiàn)，與不表達(dá)circRHOBTB3的對(duì)照（EV）組相比，circRHOBTB3過表達(dá)（circRHOBTB3-OE）組的腫瘤體積和重量都顯著更小，且細(xì)胞增殖能力也更弱（圖4A、B、C）。

而當(dāng)他們?cè)诼闶笃⑴K接種實(shí)驗(yàn)中觀察肝轉(zhuǎn)移表型時(shí)發(fā)現(xiàn)，circRHOBTB3-OE組肝轉(zhuǎn)移灶少于EV組（圖4D、E）。更為有趣的是，circRHOBTB3可以在異種移植瘤小鼠模型的血漿和尿液中檢測(cè)到，而在野生型小鼠的血漿和尿液中則沒有。此外，circRHOBTB3-OE組的血漿中circRHOBTB3的水平高于EV組（圖4F、G）。

圖4  circRHOBTB3功能的體內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)這些數(shù)據(jù)，研究者們推測(cè)CRC細(xì)胞必須通過外泌體分泌抑制腫瘤的circRHOBTB3來維持腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的特征，換言之，CRC細(xì)胞有特殊的“排毒”機(jī)制。

在隨后的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)了circRHOBTB3的環(huán)化機(jī)制，還發(fā)現(xiàn)circRHOBTB3本身的順式元件（141–240nt，141-165nt，216-240nt）可以調(diào)節(jié)circRHOBTB3通過外泌體的分泌過程（圖5）。

圖5  轉(zhuǎn)染了截?cái)嗟腸ircRHOBTB3載體的細(xì)胞中circRHOBTB3外泌體分泌豐度

之前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，ESCRT-II亞復(fù)合物作為一種RNA結(jié)合復(fù)合物，可以將RNA分選至外泌體[8]中。在該文研究中，他們發(fā)現(xiàn)SNF8可以結(jié)合到circRHOBTB3的141-240nt區(qū)域，促進(jìn)circRHOBTB3被分選至外泌體并分泌到胞外。他們將這個(gè)過程被定義為“腫瘤外泌體逃逸機(jī)制”（圖6）。

圖6  SNF8敲低實(shí)驗(yàn)以及外源的RIP實(shí)驗(yàn)

受上述研究結(jié)果啟發(fā)，研究人員設(shè)計(jì)了二代ASOs，以增加circRHOBTB3的環(huán)化并減少分泌，這有望成為一種新的癌癥治療策略。

研究人員設(shè)計(jì)了三種二代ASOs：一個(gè)靶向負(fù)環(huán)化的元件（ASO-cir：266-290nt）和兩個(gè)外泌體分泌的元件（ASO-exo1：141-165nt，ASO-exo2：216-240nt）（圖7）。

通過實(shí)驗(yàn)他們發(fā)現(xiàn)，ASO-cir確實(shí)能增加circRHOBTB3的環(huán)化，但circRHOBTB3的分泌卻會(huì)同時(shí)增加；而ASO-exo1和ASO-exo2中，僅ASO-exo2（以下簡(jiǎn)稱ASO-exo）既增加circRHOBTB3的胞內(nèi)水平，又阻斷circRHOBTB3外泌體的分泌。因此，研究者們考慮進(jìn)一步使用ASO-cir和ASO-exo，研究二者聯(lián)合治療對(duì)結(jié)直腸癌的特異性和抗腫瘤效果。

圖7 二代ASOs及其作用機(jī)制

研究人員驗(yàn)證了ASOs的聯(lián)合用藥的確比ASO-cir和ASO-exo的單獨(dú)用藥能產(chǎn)生更多的胞內(nèi)circRHOBTB3，且小鼠實(shí)驗(yàn)的結(jié)果符合預(yù)期：ASO-cir聯(lián)合ASO-exo確實(shí)顯著提高了脾臟原發(fā)病灶中circRHOBTB3的表達(dá)，還可顯著減少腫瘤惡病質(zhì)，且能控制轉(zhuǎn)移（圖8）。

圖8  ASOs體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

總的來說，這項(xiàng)研究成果闡明了circRHOBTB3調(diào)節(jié)細(xì)胞間ROS和代謝途徑來抑制CRC的進(jìn)展的機(jī)制，還且提出了一種新的腫瘤逃逸理論，即腫瘤細(xì)胞通過“排泄”腫瘤抑制circRNA來維持癌細(xì)胞的活性（“腫瘤外泌體逃逸機(jī)制”）。

更重要的是，他們?cè)O(shè)計(jì)的二代ASOs可以通過靶向環(huán)化和分泌來調(diào)控腫瘤抑制circRNA，以此促進(jìn)癌癥的治療效果。且他們的臨床數(shù)據(jù)顯示，在CRC患者中，85.7%（30/35）的腫瘤樣本攜帶的circRHOBTB3水平低于配對(duì)的正常樣本，而腫瘤樣本中circRHOBTB3的低表達(dá)與較差的預(yù)后相關(guān)。這讓我們更加相信，這種ASOs將成為未來針對(duì)CRC的一種有前途的治療策略。