易基因｜基于cfDNA甲基化的腫瘤液體活檢如何開展？

液體活檢是指通過微創(chuàng)或無創(chuàng)的方式收集血液或其他體液（包括尿液、腹水、胸腔積液等），并對其中腫瘤相關(guān)的物質(zhì)進(jìn)行分析的一種檢驗(yàn)方式。以血液為例，除了正常的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、來自正常細(xì)胞的游離 DNA (cell free DNA, cfDNA)，還可以檢測到一些來自腫瘤的物質(zhì)，包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (Circulating Tumor Cell, CTC)、循環(huán)腫瘤 DNA (Circulating Tumor DNA, ctDNA)。需要指出的是，cfDNA 可以來自正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，ctDNA 特指來自腫瘤的游離 DNA。

液體活檢，特別是對cfDNA的分析，已經(jīng)成為腫瘤學(xué)中一種具有廣闊應(yīng)用前景的非侵入性診斷方法。ctDNA甲基化可在腫瘤發(fā)生的早期被檢測到，而且具有較好的穩(wěn)定性，因此ctDNA甲基化成為腫瘤液體活檢中一個極具價值的標(biāo)志物。目前正在開發(fā)cfDNA甲基化圖譜的系統(tǒng)分析，用于癌癥的早期發(fā)現(xiàn)、微小殘留病(MRD)的監(jiān)測、預(yù)測治療效果和預(yù)后、追蹤組織來源等。本文綜述了ctDNA圖譜在早期癌癥非侵入性診斷中的優(yōu)缺點(diǎn)，并探討了ctDNA甲基化檢測在臨床應(yīng)用中的最新進(jìn)展。還總結(jié)了用于ctDNA甲基化分析的技術(shù)，并簡要概述了用于分析DNA甲基化測序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)方法。

下面將從cfDNA和ctDNA的基本概念、ctDNA甲基化檢測技術(shù)、DNA甲基化數(shù)據(jù)分析模式以及ctDNA甲基化的臨床應(yīng)用這四個方面進(jìn)行簡要概述。

1.什么是cfDNA和ctDNA？

cfDNA（cell free DNA）是指細(xì)胞游離DNA，通過細(xì)胞凋亡、壞死和分泌釋放到血液中(圖1)。cfDNA通常是雙鏈片段，長度約為150-200個堿基對。ctDNA的分子遺傳和表觀遺傳信息可以反映出起源細(xì)胞的基因組或表觀基因組。健康成年人的cfDNA濃度一般很低，通常不到每毫升血漿10微克。

在癌癥患者中，總cfDNA的某些成分是由腫瘤細(xì)胞釋放的，稱為ctDNA (Circulating Tumor DNA)。ctDNA在整個cfDNA背景中的比例變化很大，從0.05%到90%不等。影響ctDNA濃度的因素很多，包括腫瘤的體積、定位和血運(yùn)、抗腫瘤治療(如手術(shù)、化療、放療等)，以及肝和腎的清除作用。據(jù)報道，ctDNA的半衰期為16分鐘到2.5小時，這使得ctDNA分析可以作為腫瘤情況的“實(shí)時快照”。ctDNA在膀胱癌、結(jié)直腸癌和卵巢癌等癌癥類型中幾乎可以100%被檢測到，并且在其他大多數(shù)癌癥類型中也有超過50%的概率可以被檢測到，不過在膠質(zhì)瘤中只有10%的病例中可以檢測到ctDNA。同時，血漿中ctDNA濃度和可檢測到ctDNA水平也被證明與腫瘤分期有關(guān)。

圖1

2.ctDNA甲基化檢測技術(shù)

在將ctDNA甲基化分析應(yīng)用于臨床之前，需要解決的關(guān)鍵問題之一是檢測技術(shù)，它必須具有高靈敏度、成本效益和測序覆蓋率高的特點(diǎn)，特別是對于非常微量的ctDNA。目前，已經(jīng)開發(fā)了許多檢測ctDNA甲基化的方法(圖2)，大致可分為兩類：基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法和非重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化方法。表1選擇性地列出了當(dāng)前主要檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)和對cfDNA起始量的需求。

圖2

其中，重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化方法可以分為基因組甲基化檢測，代表性的方法包括全基因組甲基化測序（WGBS）和簡化基因組甲基化測序（RRBS等）。如果要檢測特定位點(diǎn)的甲基化，還可以使用靶基因重壓硫酸鹽測序（Target-BS）、焦磷酸測序、甲基化芯片和甲基化特異性PCR(MSP)。而不依賴于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法又可以分為基于富集的方法和基于限制性內(nèi)切酶的方法。表1列出了當(dāng)前主要檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)以及對cfDNA起始量的需求。

表1.液體活檢的主要甲基化檢測方法

3.DNA甲基化數(shù)據(jù)分析模式

ctDNA技術(shù)的最新發(fā)展側(cè)重于提高測序方法的分析靈敏度，這可能會受到DNA制備過程中或測序過程中引入的錯誤的影響。ctDNA甲基化與常規(guī)數(shù)據(jù)分析在分析策略上沒有明顯差異。對于基于NGS的方法，分析程序包括質(zhì)量控制(QC)、數(shù)據(jù)比對、DNA甲基化位點(diǎn)/甲基化峰確認(rèn)、DNA甲基化定量和差異甲基化位點(diǎn)/區(qū)域(DMS/DMR)鑒定。結(jié)合測序文庫的準(zhǔn)備，每種測量方法對應(yīng)的分析細(xì)節(jié)在某些步驟上是不同的，下面介紹常用的分析程序：

質(zhì)量控制(QC)和數(shù)據(jù)比對：即對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，保留高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，并將質(zhì)控后的數(shù)據(jù)與人類參考基因組進(jìn)行比對。

定量DNA甲基化位點(diǎn)/峰：對于亞硫酸氫鹽測序方法，甲基化位點(diǎn)由比對中未改變的C位點(diǎn)決定，獲得的每個CpG位點(diǎn)的甲基化水平是一個連續(xù)變量，通過使用未甲基化的C在測序的總C中的比例來計算。

差異甲基化位點(diǎn)/區(qū)域(DMS/DMR)鑒定：在進(jìn)行回歸分析時，可以添加協(xié)變量校正以消除混雜因素的影響，如年齡和性別。在小樣本量的情況下，多個相鄰的CpG位點(diǎn)應(yīng)合并到一個定義的區(qū)域，稱為DMR，以提高統(tǒng)計性能。

癌癥特異性cfDNA甲基化生物標(biāo)志物的鑒定：通常的步驟是(i)獲得癌癥和健康cfDNA之間的DMRs；(ii)獲得癌癥cfDNA和外周血單核細(xì)胞(PBMC)基因組DNA的DMRs；(iii)前述DMRs的共有區(qū)域?yàn)槟[瘤特異性DMRs，同時將無腫瘤PBMC的甲基化譜作為陰性對照。

4. ctDNA甲基化的臨床應(yīng)用場景

ctDNA甲基化在精確腫瘤學(xué)中的臨床應(yīng)用場景主要有以下幾個方面：

癌癥篩查：篩查疾病標(biāo)志物，以便對無癥狀個體的癌癥進(jìn)行早期干預(yù)。

癌癥檢測：癌癥的早期檢測可以使治療盡早開始。如果腫瘤被早期診斷，可以進(jìn)行根治性手術(shù)，以提高患者的治愈率。對于有癥狀的患者，靈敏而特異的癌癥檢測可以加快診斷和治療的時間。

微小殘留病和復(fù)發(fā)監(jiān)測：識別復(fù)發(fā)風(fēng)險高的殘留病患者，這可用于在接受輔助治療之前對患者進(jìn)行分級。有效的分級將防止低風(fēng)險患者過度治療，防止高?；颊咧委煵蛔?。MRD可以比目前的方法提前幾個月預(yù)測復(fù)發(fā)。

評估治療效果：ctDNA動態(tài)與治療反應(yīng)相關(guān)，能夠在臨床復(fù)發(fā)前提示治療效果。治療監(jiān)測可以確定反應(yīng)或進(jìn)展，使臨床醫(yī)生和患者能夠相應(yīng)地選擇治療方案。

預(yù)后價值：對進(jìn)展風(fēng)險的評估對于治療策略的選擇至關(guān)重要。

追蹤ctDNA的組織來源：確定cfDNA的組織來源具有重大的生物學(xué)意義和潛在診斷價值。

下表列舉了近期基于DNA甲基化的癌癥液體活檢研究的部分綜述，感興趣的小伙伴也可檢索文獻(xiàn)閱讀。

總體而言，ctDNA甲基化是腫瘤早期或復(fù)發(fā)早期的重要信號，檢測體液中的ctDNA 甲基化對于腫瘤的篩查、早期診斷、預(yù)后判斷、復(fù)發(fā)檢測、療效評估等關(guān)鍵難題極具應(yīng)用價值。

cfDNA甲基化檢測技術(shù)瓶頸：

對于cfDNA等相對微量且片段化十分嚴(yán)重的樣本，常用甲基化檢測主要包括cfMeDIP，微量WGBS技術(shù)。應(yīng)用RRBS檢測的CG位點(diǎn)極為有限，主要原因cfDNA自身就在選擇片段范圍之內(nèi)，如果片段內(nèi)CG含量高被酶切，反而更短不被富集，因此可能檢測到的都是CG含量低的區(qū)域片段。

WGBS，太貴！

RRBS，位點(diǎn)太少！

新技術(shù)推介：

為助力低樣本量多維度分析，深圳市易基因科技開發(fā)了富集覆蓋CpG島、啟動子、增強(qiáng)子、CTCF結(jié)合位點(diǎn)的cfDNA甲基化測序方法——cfDNA-RBS，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度和樣本復(fù)用，使其具有高度可擴(kuò)展性，并適用于有限的樣本和單個細(xì)胞。

易基因建立的cfDNA-RBS技術(shù)，僅需15-20G測序數(shù)據(jù)，DNA建庫起始量低至1ng的cfDNA樣本，可以檢測10M有效CG位點(diǎn)覆蓋，是目前腫瘤甲基化標(biāo)志物檢測研究的優(yōu)選技術(shù)。

微量cfDNA簡化基因組甲基化測序（cfDNA-RBS）：

100ul血漿或1ng cfDNA

10M有效CG位點(diǎn)覆蓋

15-20G測序數(shù)據(jù)量

WGBS、cfDNA-RBS、RRBS系列技術(shù)指標(biāo)比較

*以上技術(shù)數(shù)據(jù)，由深圳市易基因科技有限公司提供。

參考文獻(xiàn)：https:///10.1016/j.molmed.2020.12.01

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