【原】易基因：基于cfDNA甲基化的液體活檢在胰腺疾病中的研究進(jìn)展 | 3文一覽

深圳易基因科技 2022-03-14

展開(kāi)全文

大家好，這里是專注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。

本期通過(guò)3篇基于cfDNA甲基化的液體活檢在早期檢測(cè)胰腺疾病中的研究成果，對(duì)cfDNA甲基化液體活檢在疾病早期診斷中的研究進(jìn)展及其對(duì)于胰腺疾病治療的潛在價(jià)值進(jìn)行討論。（特別說(shuō)明：僅分析討論論文的主要組織結(jié)構(gòu)和框架思路，不關(guān)心論文具體研究的科學(xué)問(wèn)題）

01 cfDNA甲基化譜準(zhǔn)確預(yù)測(cè)急性胰腺炎嚴(yán)重程度

標(biāo)題：Accurate prediction of acute pancreatitis severity based on genome-wide cell free DNA methylation profiles

期刊：Clin Epigenetics

影響因子：IF 6.551

發(fā)表時(shí)間：2021.12.16

技術(shù)平臺(tái)：RRBS

背景：

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）患者死亡率較高，因此早期診斷和提前干預(yù)對(duì)提高患者生存率至關(guān)重要，然而常規(guī)檢查在急性胰腺炎（AP）分層中受到限制。本研究目的是通過(guò)將豐富的臨床檢測(cè)結(jié)果和cfDNA甲基化標(biāo)志物相結(jié)合來(lái)評(píng)估AP的嚴(yán)重程度。

方法：

在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集61例AP患者的175份血液樣本，并采集24份健康人群的血液樣本作為對(duì)照組。所有樣本的全基因組cfDNA甲基化譜均采用簡(jiǎn)化重亞硫酸鹽測(cè)序（cfDNA-RRBS進(jìn)行表征?；赾fDNA甲基化和常規(guī)血液生物標(biāo)志物單獨(dú)和組合構(gòu)建SAP預(yù)測(cè)模型。對(duì)AP患者進(jìn)行覆蓋93種生物標(biāo)志物的臨床血液檢測(cè)。

研究設(shè)計(jì)、預(yù)測(cè)模型構(gòu)建和驗(yàn)證流程圖

結(jié)果：

利用RRBS測(cè)序技術(shù)繪制的cfDNA全基因組甲基化譜，作者共鑒定出565個(gè)AP標(biāo)志物和59個(gè)SAP標(biāo)志物，預(yù)測(cè)急性胰腺炎及其嚴(yán)重程度?；赾fDNA甲基化標(biāo)志物構(gòu)建的AP和SAP預(yù)測(cè)模型AUC值（Area Under Curve）分別為0.92和0.81。系統(tǒng)篩選12種常規(guī)血液生物標(biāo)志物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12種標(biāo)志物對(duì)SAP的敏感性為87.5%，對(duì)輕度急性胰腺炎的特異性為100%，顯著高于現(xiàn)有的血液檢測(cè)。將12種常規(guī)血液生物標(biāo)志物與59種cfDNA甲基化標(biāo)志物相結(jié)合的擴(kuò)展模型進(jìn)一步將SAP預(yù)測(cè)敏感性提高至92.2%。

圖：常規(guī)臨床試驗(yàn)檢測(cè)的血液生物標(biāo)志物水平可用于SAP早期的準(zhǔn)確診斷

結(jié)論：

以上研究結(jié)果表明，通過(guò)將傳統(tǒng)常規(guī)檢查和新型血液分子標(biāo)志物相結(jié)合，可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)SAP，為通過(guò)非侵入式快速診斷進(jìn)行SAP早期有效干預(yù)奠定基礎(chǔ)。

02 cfDNA甲基化特征區(qū)分胰腺癌和良性胰腺囊腫

標(biāo)題：Liquid biopsy, using a novel DNA methylation signature, distinguishes pancreatic adenocarcinoma from benign pancreatic disease

期刊：Clin Epigenetics

影響因子：IF 6.551

發(fā)表時(shí)間：2022.02.22

技術(shù)平臺(tái)：qPCR

摘要：

本研究驗(yàn)證了血液樣本中cfDNA甲基化標(biāo)志物在區(qū)分轉(zhuǎn)移性胰腺癌和良性胰腺囊腫的能力，并使用定量cfDNA甲基化分析來(lái)監(jiān)測(cè)腫瘤動(dòng)力學(xué)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)cfDNA甲基化標(biāo)志物能夠以高敏感性和特異性來(lái)區(qū)分惡性樣本和良性疾病樣本（AUC = 0.999）。此外，生物標(biāo)志物能夠檢測(cè)到接受化療的患者樣本中腫瘤源性cfDNA甲基化持續(xù)下降。本研究證明cfDNA甲基化生物標(biāo)志物從血漿中檢測(cè)到轉(zhuǎn)移性胰腺癌，區(qū)分惡性胰腺癌和良性胰腺囊腫。表明液體活檢可能在胰腺癌患者的治療中發(fā)揮必要的作用。

背景：

胰腺癌（PDAC）是一種相對(duì)罕見(jiàn)的疾病，占所有癌癥病例的3%；然而由于大部分PDAC屬于晚期診斷，其5年生存率僅為10%。癌癥及其復(fù)發(fā)的早診斷早干預(yù)，可能改善疾病的管理。臨床上可用的血液生物標(biāo)志物，如糖類抗原19-9(Carbohydrate antigen19-9,CAl9-9)在檢測(cè)早期胰腺癌不準(zhǔn)確，其在炎癥性胰腺炎和膽道梗阻的情況下可能呈假陽(yáng)性結(jié)果，在Lewis抗原陰性的晚期患者中可能結(jié)果正常。而從血液活檢中檢測(cè)cfDNA中腫瘤特異性DNA甲基化可用于胰腺癌的診斷和監(jiān)測(cè)。

方法：

隊(duì)列：19例未手術(shù)切除的轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者（實(shí)驗(yàn)組） VS 44例良性胰腺囊腫患者（對(duì)照組）。所有癌癥病例在抽血時(shí)均經(jīng)病理檢查為胰腺癌， 9名實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者在治療開(kāi)始前（C1周期）和治療開(kāi)始后4周（C2周期）采集樣本。采集血液并提取分離cfDNA和重亞硫酸鹽處理，兩步法qPCR。

結(jié)果：

（1）基于cfDNA甲基化生物標(biāo)志物的液體活檢，可以區(qū)分良性和惡性胰腺疾病，具有非常高的敏感性和特異性。

圖：A. 對(duì)照組44例良性胰腺囊腫患者樣本和19例胰腺癌患者樣本的每個(gè)標(biāo)志物平均DNA甲基化水平

B. 44名對(duì)照組樣本和19名癌癥患者樣本的生物標(biāo)志物ROC分析

（2）胰腺癌治療期間cfDNA甲基化標(biāo)志物縱向變化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)cfDNA甲基化水平降低可能與較低的疾病負(fù)荷相關(guān)。胰腺癌治療過(guò)程導(dǎo)致血漿中腫瘤源性DNA減少，表明cfDNA甲基化生物標(biāo)志物可能有助于監(jiān)測(cè)接受胰腺癌治療的患者。

圖：DNA甲基化生物標(biāo)志物在檢測(cè)胰腺癌治療后疾病負(fù)荷的差異

03 cfDNA甲基化全基因組分析用于胰腺癌早期診斷

標(biāo)題：Genome-Wide Analysis of Cell-Free DNA Methylation Profiling for the Early Diagnosis of Pancreatic Cancer

期刊：Front Genet.

影響因子：IF 4.599

發(fā)表時(shí)間：2020.12.02

技術(shù)平臺(tái)：cfMeDIP-seq

研究背景：

近年來(lái)，cfDNA液體活檢由于其臨床優(yōu)勢(shì)而引起了醫(yī)學(xué)界的更多關(guān)注。在腫瘤發(fā)生期間，細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡的增加導(dǎo)致cfDNA富集，可以在相對(duì)較早的階段檢測(cè)到。此外，cfDNA不僅包含與腫瘤細(xì)胞相同的突變，而且具有相同的甲基化模式，從而為早期癌癥診斷，甚至對(duì)于那些隱藏的器官（如胰腺和膽管）的診斷提供了可能和便利。本研究旨在通過(guò)MeDIP-seq鑒定胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）診斷中潛在的cfDNA甲基化生物標(biāo)志物。

方法：

通過(guò)MeDIP-seq分析，將PDAC的cfDNA差異甲基化區(qū)域（DMR）與正常對(duì)照組進(jìn)行比較，鑒定出143個(gè)高甲基化DMRs，主要位于基因啟動(dòng)子區(qū)域并與CGI重疊。再與公開(kāi)的DNA甲基化數(shù)據(jù)交叉驗(yàn)證后，鑒定出可以用作PDAC患者早期檢測(cè)的八個(gè)生物標(biāo)志物，包括TRIM73，F(xiàn)AM150A，EPB41L3，SIX3，MIR663，MAPT，LOC100128977和LOC100130148。

胰腺癌cfDNA甲基化生物標(biāo)志物篩選流程圖

結(jié)果：

（1）PDAC患者和健康對(duì)照組樣本之間存在表觀遺傳學(xué)差異

（2）胰腺癌患者和健康對(duì)照組啟動(dòng)子區(qū)域的差異甲基化區(qū)域（DMR）

（3）胰腺癌患者和健康對(duì)照組CpG區(qū)域的差異甲基化區(qū)域（DMR）

（4）胰腺癌患者樣本在啟動(dòng)子和CGIs區(qū)域中的差異甲基化基因

（5）使用公開(kāi)的DNA甲基化數(shù)據(jù)交叉驗(yàn)證潛在的候選基因

（6）胰腺癌患者與正常對(duì)照組之間8個(gè)標(biāo)志物DNA甲基化水平分析

結(jié)論：

通過(guò)MeDIP-seq技術(shù)對(duì)全基因組cfDNA甲基化進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了8種可用于早期胰腺癌的非侵入性診斷的潛在生物標(biāo)志物，有望成為臨床胰腺癌早期診斷的有效方法。這8種胰腺癌生物標(biāo)記物分別為：MAPT、SIX3、MIR663、EPB41L3、FAM150A、TRIM73、LOC100128977和LOC100130148。

關(guān)于cfDNA甲基化檢測(cè)

WGBS，太貴！

RRBS，位點(diǎn)太少！

對(duì)于cfDNA等相對(duì)微量且片段化十分嚴(yán)重的樣本，常用甲基化檢測(cè)主要包括cfMeDIP，微量WGBS技術(shù)。應(yīng)用RRBS檢測(cè)的CG位點(diǎn)極為有限，主要原因cfDNA自身就在選擇片段范圍之內(nèi)，如果片段內(nèi)CG含量高被酶切，反而更短不被富集，因此可能檢測(cè)到的都是CG含量低的區(qū)域片段。

為助力低樣本量多維度分析，易基因開(kāi)發(fā)了富集覆蓋CpG島、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、CTCF結(jié)合位點(diǎn)的cfDNA甲基化測(cè)序方法——cfDNA-RBS，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度和樣本復(fù)用，使其具有高度可擴(kuò)展性，并適用于有限的樣本和單個(gè)細(xì)胞。

易基因建立的cfDNA-RBS技術(shù)，僅需10-15G測(cè)序數(shù)據(jù)，DNA建庫(kù)起始量低至5ng的cfDNA樣本，可以檢測(cè)到的5X位點(diǎn)高達(dá)4M以上，是目前腫瘤甲基化標(biāo)志物檢測(cè)研究的優(yōu)選技術(shù)，應(yīng)用場(chǎng)景包括腫瘤早篩、腫瘤診斷、個(gè)性化用藥、實(shí)時(shí)監(jiān)控、預(yù)后監(jiān)測(cè)等。