哲學家說：世界上沒有兩片完全相同的樹葉。現(xiàn)代科學發(fā)現(xiàn)：世界上也沒有兩顆完全相同的腫瘤細胞。

即使是在同一腫瘤內，由于腫瘤的基因組不穩(wěn)定性，以及腫瘤微環(huán)境的差異，腫瘤細胞的基因型或亞型也不盡相同，生物學行為也千差萬別[1]。這種腫瘤內的異質性，是導致癌癥進展和耐藥的重要原因。癌細胞亞群之間的合作，對于維持腫瘤內異質性至關重要。然而，這種互動如何進行，仍然是個謎。

細胞外囊泡是細胞分泌的微小囊泡，含蛋白質和核酸等內容物。細胞外囊泡能利用膜上信號分子和泡內內容物對受體細胞進行調控，也是細胞間通訊的中心介質[2]。但是，腫瘤細胞亞群間的細胞外囊泡通訊機制，尚未完全闡明。

近日，來自葡萄牙波爾圖大學團隊，首次發(fā)現(xiàn)在胰腺癌內，癌干細胞通過分泌細胞外囊泡，聯(lián)合非干細胞，組建腫瘤內通訊網絡；這一細胞外囊泡通訊網絡具有可塑性，憑借Agrin/LRP-4/YAP通路，促進胰腺癌生長；Agrin陽性的細胞外囊泡能預測胰腺癌預后，靶向Agrin可作為治療胰腺癌的新策略。該研究成果目前已在消化病學頂級期刊Gut在線出版[3]。

論文首頁截圖

首先，研究人員根據(jù)腫瘤干性相關的表面標志物，把胰腺癌細胞分選為兩類四個亞群：占少數(shù)的癌干細胞CD133 細胞和CD24 CD44 細胞；占多數(shù)的非干細胞CD24?CD44 細胞和4N（CD24?CD44?CD133?EpCAM?）細胞。然后，混合這些亞群，追蹤細胞外囊泡在它們之間的流動。

共聚焦成像分析發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)細胞接收了其他細胞分泌的外囊泡，其中，胰腺癌干細胞分泌的顯著多于胰腺癌非干細胞。胰腺癌細胞亞群通過細胞外囊泡，以癌干細胞至非干細胞方向為主，構建了一個有組織的細胞間通訊網絡。

圖E：各細胞亞群接收其他亞群細胞分泌的外囊泡，其中，胰腺癌干細胞分泌的顯著多于胰腺癌非干細胞；圖F：以癌干細胞至非干細胞方向為主的細胞外囊泡通訊網絡。（CSC：癌干細胞，NSCC：癌非干細胞，EVs：細胞外囊泡，EVNet：細胞外囊泡通訊網絡）

那么，這個通訊網絡，對于胰腺癌細胞的生存，又有怎樣的意義？研究人員探討了低氧和化療等不利條件下，細胞外囊泡通訊網絡的改變，以及對胰腺癌細胞的影響。

降低腫瘤微環(huán)境中的氧含量后，研究人員發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細胞分泌細胞外囊泡增多，接收外源的細胞外囊泡也增多，細胞之間的外囊泡通訊更加頻繁，但是，癌干細胞至非干細胞，仍是外囊泡的主要流動方向。

然而，對胰腺癌細胞予以化療藥物處理后，細胞外囊泡的通訊頻率沒有變化，但主要途徑卻發(fā)生了改變，出現(xiàn)在了非干細胞亞群之間。由此可見，面對微環(huán)境的變換，胰腺癌細胞能重塑細胞外囊泡通訊。

圖E和F：低氧導致細胞外囊泡通訊頻率更加頻繁；圖G和H：化療改變細胞外囊泡通訊主要途徑（Hypoxia：低氧，Gemcitabine：吉西他濱，一種腫瘤化療藥）

Rab27a參與細胞外囊泡的形成[4]。于是，研究人員敲除Rab27a（這并不影響其他無關蛋白的分泌），破壞外囊泡通訊網絡，觀察低氧和化療對胰腺癌細胞的影響。結果顯示，細胞外囊泡分泌減少后，缺氧和化療讓胰腺癌細胞死亡比例顯著升高，對微環(huán)境的改變更敏感。因此，細胞外囊泡通訊有助于癌細胞適應微環(huán)境變化。

接下來，研究人員進行了動物實驗，在體內環(huán)境中探究細胞外囊泡通訊對腫瘤的影響。研究人員構建Rab27a功能缺失型胰腺癌鼠模型，發(fā)現(xiàn)Rab27被抑制后，腫瘤生長顯著減慢，肝臟轉移的數(shù)量顯著減少。Rab27a敲除會損害細胞外囊泡通訊，從而破壞胰腺癌進展。

Rab27a敲除后，圖B：胰腺癌生長減慢；圖C：肝臟轉移的胰腺癌數(shù)量顯著減少。（Control：Rab27a野生型小鼠，Doxycycline：多西環(huán)素誘導的Tet-on系統(tǒng)Rab27a敲除小鼠）

由于細胞外囊泡通訊中最頻繁的路徑是從癌干細胞至非干細胞，研究人員猜測：是否只要抑制癌干細胞的細胞外囊泡，就足以抑制胰腺癌生長？

研究人員分別構建了Rab27a敲除癌干細胞胰腺癌鼠模型，和Rab27a敲除非干細胞胰腺癌鼠模型，發(fā)現(xiàn)只有胰腺癌干細胞Rab27a敲除鼠，腫瘤發(fā)病延遲，腫瘤的發(fā)生和轉移率降低，存活率提高。這些結果表明，Rab27a敲除對癌干細胞外囊泡的抑制，才是損害胰腺癌發(fā)生發(fā)展的原因。

胰腺癌干細胞在Rab27a敲除后，原位移植至鼠，構建Rab27a敲除癌干細胞胰腺癌鼠模型，圖B：腫瘤發(fā)病延遲；圖C：腫瘤生長減慢；圖D：腫瘤質量減小

那么，癌干細胞外囊泡是因為有何獨特成分，才具有這樣的獨特功能？研究人員，對癌干細胞和非干細胞的細胞外囊泡的蛋白組分，進行了比較。

質譜和通路分析發(fā)現(xiàn)，相比于癌非干細胞外囊泡，癌干細胞外囊泡顯著富集軸突引導通路蛋白，通路中的Agrin表達上調。而胰腺癌非干細胞外囊泡，則高度表達LRP-4。

既往研究已證實軸突引導通路的異常活化能促進胰腺癌的發(fā)生，而在其他腫瘤中Agrin可通過結合LRP-4激活轉錄因子YAP，促進腫瘤轉移，降低預后期望[5]。

于是，研究人員在胰腺癌細胞中對Agrin/LRP-4/YAP通路進行了驗證：胰腺癌干細胞和非干細胞共培養(yǎng)，癌干細胞的Agrin與LRP-4能共定位，并被癌非干細胞吞飲；敲除癌干細胞的Agrin后，癌非干細胞外囊泡內YAP活性水平顯著降低。

圖G：癌干細胞外囊泡富集軸突引導通路蛋白；圖H：通路中的Agrin表達上調；圖E：癌干細胞的Agrin與LRP-4共定位，被癌非干細胞吞飲

接著，研究人員進行了動物實驗，發(fā)現(xiàn)癌干細胞Agrin的表達下調能導致小鼠胰腺癌發(fā)病時間明顯延遲，腫瘤生長顯著減慢，腫瘤體積明顯縮小，癌細胞中活性YAP的表達顯著下調。Agrin可作為治療胰腺癌的新靶點。

圖C：癌干細胞Agrin敲減后腫瘤體積減小；圖G：使用抗體下調Agrin的表達，活性YAP的表達也下調，細胞活性減弱

最后，研究人員在胰腺癌臨床樣本中對Agrin進行了檢測，發(fā)現(xiàn)患者血清細胞外囊泡Agrin陽性的比例與腫瘤負荷成正比；在未接受手術的患者中，Agrin陽性比例每增加1%，疾病進展的風險增加2.94倍；而且，Agrin陽性細胞外囊泡的增加早于胰腺癌疾病進展的影像學改變。ROC曲線顯示血清Agrin陽性細胞外囊泡預測胰腺癌預后，AUC達到0.77，可作為胰腺癌一個新的良好的預后生物標志物。

圖A：手術后隨著腫瘤負荷降低，血清中Agrin陽性細胞外囊泡比例下降；圖B：化療后隨著腫瘤負荷降低，血清中Agrin陽性細胞外囊泡比例下降；；圖F：ROC曲線顯示血清Agrin陽性細胞外囊泡預測胰腺癌預后，AUC達到0.77

作為生存率最低的腫瘤，胰腺癌被稱為“萬癌之王”。腫瘤內異質性作為胰腺癌一個突出特征，是導致治療抵抗、預后欠佳的罪魁禍首[6]。

這項研究是當前人類在胰腺癌中第一次發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞外囊泡通訊網絡，從細胞外囊泡的角度揭示了胰腺癌的腫瘤內異質性，細胞亞群的差異和互動，并發(fā)掘了一個預測性能良好的胰腺癌生物標志物，治療胰腺癌的新靶點。細胞外囊泡，也許，會是協(xié)助我們攀登胰腺癌雪山的登山杖。

參考文獻：

[1] Hermann PC, Huber SL, Herrler T, et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 2007;1(3):313-323. doi:10.1016/j.stem.2007.06.002

[2] Bastos N, Ruivo CF, da Silva S, Melo SA. Exosomes in cancer: Use them or target them?. Semin Cell Dev Biol. 2018;78:13-21. doi:10.1016/j.semcdb.2017.08.009

[3] Ruivo CF, Bastos N, Adem B, et al. Extracellular Vesicles from Pancreatic Cancer Stem Cells Lead an Intratumor Communication Network (EVNet) to fuel tumour progression [published online ahead of print, 2022 Jan 10]. Gut. 2022;gutjnl-2021-324994. doi:10.1136/gutjnl-2021-324994

[4] Ostrowski M, Carmo NB, Krumeich S, et al. Rab27a and Rab27b control different steps of the exosome secretion pathway. Nat Cell Biol. 2010;12(1):19-13. doi:10.1038/ncb2000

[5] Chakraborty S, Lakshmanan M, Swa HL, et al. An oncogenic role of Agrin in regulating focal adhesion integrity in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 2015;6:6184. Published 2015 Jan 29. doi:10.1038/ncomms7184

[6] Bernard V, Semaan A, Huang J, et al. Single-Cell Transcriptomics of Pancreatic Cancer Precursors Demonstrates Epithelial and Microenvironmental Heterogeneity as an Early Event in Neoplastic Progression. Clin Cancer Res. 2019;25(7):2194-2205. doi:10.1158/1078-0432.CCR-18-1955

責任編輯丨代絲雨