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如果你需要大海里特定品種的魚(yú)，你會(huì)選擇用漁網(wǎng)直接捕撈， 還是選擇投放特制魚(yú)餌，吸引目標(biāo)魚(yú)上鉤？ 相信睿智的你，肯定會(huì)選擇后者！ 靶向測(cè)序的核心，即靶向富集目標(biāo)序列。 下面小燃帶你去看看如何在大海中靶向捕“魚(yú)”。 01 靶向測(cè)序方法介紹 目標(biāo)區(qū)域測(cè)序，又稱靶向測(cè)序，是指目標(biāo)序列富集后測(cè)序的研究策略。它可根據(jù)不同的應(yīng)用，利用較低的數(shù)據(jù)量得到理想的靈敏度和準(zhǔn)確度。相較全基因組與全外顯子測(cè)序，靶向測(cè)序能夠聚焦目標(biāo)區(qū)域，去除冗余數(shù)據(jù)干擾，測(cè)序成本低且測(cè)序深度深，能高效經(jīng)濟(jì)發(fā)揮NGS技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，并廣泛應(yīng)用到臨床檢測(cè)、疾病篩查等眾多領(lǐng)域。 現(xiàn)在常用的靶向測(cè)序方法主要有三類[1]： I. 雜交捕獲法（Hybrid capture） II. 分子倒置探針富集法（Molecular inversion probes，MIP) III. PCR富集法 我們從原理入手，先來(lái)認(rèn)識(shí)下這三種靶向測(cè)序方法。  雜交捕獲法 雜交捕獲法包括固相和液相雜交捕獲法兩類。固相雜交捕獲法是先選定目標(biāo)DNA區(qū)域，在芯片上修飾與目標(biāo)區(qū)域互補(bǔ)的探針；隨后在芯片上進(jìn)行DNA與探針的雜交反應(yīng)；最后將與探針雜交的DNA洗脫下來(lái)用于后續(xù)的測(cè)序工作（圖1左）。目前市面上的代表產(chǎn)品是Roche NimbleGen，特點(diǎn)是使用超高密度、疊瓦式排布的DNA探針，具有高富集均一度等。 液相雜交捕獲法是目前被廣泛應(yīng)用的靶向測(cè)序方法，根據(jù)堿基互補(bǔ)原理定制帶有生物素的探針，在液相中與目的序列雜交，通過(guò)鏈酶親和素修飾的磁珠吸附帶有生物素的探針，富集目的DNA片段（圖1右）。 圖1.雜交捕獲方法（固相+液相）[1] 分子倒置探針富集法 分子倒置探針富集法即通過(guò)設(shè)計(jì)口袋型的探針，此探針兩端(紅色序列Target complementary region）能與目的區(qū)域退火，然后利用DNA聚合酶及連接酶補(bǔ)平缺口成完整的環(huán)狀探針，通過(guò)外切酶將游離的探針消化。完整的探針與目標(biāo)區(qū)段的序列，利用通用序列作為后續(xù)文庫(kù)構(gòu)建的引物[黑色序列，即PCR Primer, Probe-release clevage site；綠色序列用于Hybridization based detection；藍(lán)色序列Tag-release clevage site]，后續(xù)添加帶有生物素標(biāo)記的核苷酸（黃色序列）與其過(guò)夜雜交，產(chǎn)物可直接作為二代測(cè)序文庫(kù)。但此法由于捕獲均一性差探針成本高，目前鮮有使用。 圖2.分子倒置探針富集法[1] PCR富集法 多重?cái)U(kuò)增PCR，又稱擴(kuò)增子建庫(kù)技術(shù)。 該技術(shù)首先利用多重引物PCR反應(yīng)，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)區(qū)域序列，得到的擴(kuò)增子產(chǎn)物通過(guò)PCR或酶連接反應(yīng)，將二代測(cè)序接頭序列（adapter）引入，得到擴(kuò)增子文庫(kù)，進(jìn)行靶向測(cè)序[2]。 圖3. 基于PCR的富集法[8] 02 靶向測(cè)序策略選擇 從富集基因數(shù)及樣本數(shù)比較不同方法學(xué)的適用性及可行性，代入樣本量及單個(gè)樣本所需檢測(cè)基因數(shù)可獲得合適的檢測(cè)方法，但選擇合適的測(cè)序方法還需考慮更多因素（圖4）。 表1則分別從成本，適用性、樣本量、靈敏度、特異性、一致性及重復(fù)性各方面作比較。 表1.靶向測(cè)序方法介紹[1] 靶向測(cè)序策略各方法學(xué)性能對(duì)比簡(jiǎn)單歸納如下： PCR富集法：靈敏度高，檢測(cè)速度快；但其檢測(cè)區(qū)域小，一般適用于少量基因或者熱點(diǎn)突變的檢測(cè)；另外同時(shí)使用多對(duì)引物可能產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增和二聚體，且擴(kuò)增的GC偏好導(dǎo)致覆蓋均一度差（影響CNV），是PCR富集法相比雜交捕獲法的一大劣勢(shì)。 MIP富集法：無(wú)需剪切基因組DNA即可捕獲目的序列，探針含測(cè)序引物等，因此樣本質(zhì)量要求低且建庫(kù)時(shí)長(zhǎng)短。但面對(duì)目的長(zhǎng)序列及高GC含量區(qū)，MIP探針設(shè)計(jì)困難且均一度差，捕獲效率低，目前鮮有使用。 雜交捕獲法：探針設(shè)計(jì)為重中之重，捕獲效率均一性表現(xiàn)優(yōu)異。雜交捕獲方法能夠在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中比PCR更快，更方便地捕獲大目標(biāo)區(qū)域。 其中固相雜交相比多重PCR，其對(duì)大區(qū)域的富集有明顯優(yōu)勢(shì)，且固相雜交代表產(chǎn)品NimbleGen SeqCap的超高密度疊瓦式探針排布策略靈敏度高，所需的測(cè)序深度更低，但需要微陣列玻片及昂貴的硬件。液相雜交無(wú)需專門(mén)設(shè)備即可進(jìn)行溶液內(nèi)靶標(biāo)富集，比固相雜交更易于擴(kuò)展，靈敏度和特異性也表現(xiàn)優(yōu)異。 下面重點(diǎn)介紹應(yīng)用最為廣泛的液相雜交捕獲法，各性能主要取決于探針?lè)N類、設(shè)計(jì)等，具體區(qū)別如下： ■ 核酸探針比較 核酸探針類型分為RNA和DNA[3]兩類，DNA探針又分為ssDNA和dsDNA[4]，具體特點(diǎn)[5][6][7]如下： 表2. 核酸探針類型比較 此外，基于不同類型探針的特異性限定（即雜交的錯(cuò)配容忍度）及合成成本等因素，匯總目前市面上不同品牌探針?lè)诸惾缦?/span>[4][5][8][9][10]：
表3.不同品牌探針?lè)诸惣伴L(zhǎng)度對(duì)比 ■ 探針覆蓋策略比較 比較固相雜交（NimbleGen SeqCap）、液相雜交（Agilent SureSelect）、MIP （Agilent Haloplex）和PCR（illumina Nextera）的覆蓋策略（圖5）各方法的不同參數(shù)結(jié)果。
圖5.不同方法對(duì)目標(biāo)區(qū)域的覆蓋策略[11] 可見(jiàn)MIP選擇覆蓋目標(biāo)區(qū)域兩側(cè)，其他探針都是直接覆蓋目標(biāo)區(qū)域。SeqCap探針密度更高、疊瓦式設(shè)計(jì)，Agilent采用RNA探針等策略[13]。不同探針長(zhǎng)度、設(shè)計(jì)方式及探針之間的覆蓋程度策略，直接影響文庫(kù)復(fù)雜度，均一性等測(cè)序結(jié)果。 ■ 探針設(shè)計(jì)參數(shù) 密度與交錯(cuò)程度Density: End to end是常規(guī)探針設(shè)計(jì)方式，密度表示目標(biāo)區(qū)域中每個(gè)核苷酸所需探針數(shù)。 Overlap tilling是設(shè)計(jì)疊瓦式探針。 重復(fù)序列的捕獲程度Masking： 高拷貝重復(fù)區(qū)，設(shè)計(jì)時(shí)降低探針密度，減少非特異序列的結(jié)合。 高GC區(qū)探針彌補(bǔ)Boosting： 高通量測(cè)序過(guò)程當(dāng)中，高GC區(qū)段被測(cè)到的概率會(huì)比較低。因此需要針對(duì)高GC區(qū)域多設(shè)計(jì)探針彌補(bǔ)GC Bias[14]。 此外，不同雜交捕獲探針設(shè)計(jì)時(shí)參考數(shù)據(jù)庫(kù)以及可捕獲范圍也會(huì)有所區(qū)別[15]。 03 小結(jié) 所謂合適的才是最好的，實(shí)驗(yàn)室選擇靶向測(cè)序方法及產(chǎn)品時(shí)應(yīng)充分考慮[12]： I. 實(shí)驗(yàn)室條件及設(shè)計(jì)方案的比較： 如商品化試劑盒是否滿足需求，起始樣本在質(zhì)量和數(shù)量上有無(wú)要求，成本等； II. 性能因素： 實(shí)驗(yàn)的簡(jiǎn)便性及可擴(kuò)展性，時(shí)間成本，是否能自動(dòng)化和所需要專用硬件的要求等； III.富集和測(cè)序效果的比較： 突變類型，中靶率，覆蓋均一性及靈敏度等。 如果文章對(duì)您有所幫助，歡迎點(diǎn)贊和分享 贊與不贊，小燃都在這里，我們下期再見(jiàn)！ 參考資料： [1]Mamanova, L., Coffey, A., Scott, C. et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nat Methods 7, 111–118 (2010). [2]https://www./techniques/sequencing.html [3]Gnirke, A., Melnikov, A., Maguire, J. et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nat Biotechnol 27, 182–189 (2009). [4]https://www. [5]https://www. [6]Marcy, Joshua. 'RNA Methods: A Lab Guide.(RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization)(Brief Article)(Book Review).' Genomics & Proteomics June(2005). [7]Janine, Meienberg , et al. New insights into the performance of human whole-exome capture platforms. Nuclc Acids Research 43.11(2015):e76-e76. [8]https://www. [9]https://www. [10]https://sg./pages [11]Samorodnitsky, Eric, Datta, Jharna, Jewell, Benjamin M. et al. Comparison of Custom Capture for Targeted Next-Generation DNA Sequencing.Journal of Molecular Diagnostics Jmd (2015). [12]Kozarewa, Iwanka , et al. Overview of Target Enrichment Strategies.Current Protocols in Molecular Biology 112(2015):7.21.1. [13]https://earray.chem./suredesign/help/Create_a_SureSelect_design_with_the_wizard.htm [14]https://www./zh-cn/video/custom-sureselect-design [15]Clark, M., Chen, R., Lam, H. et al. Performance comparison of exome DNA sequencing technologies. Nat Biotechnol 29, 908–914 (2011).  關(guān)于燃石醫(yī)學(xué) 燃石醫(yī)學(xué)（納斯達(dá)克代碼：BNR）成立于2014年，公司使命為“用科學(xué)守護(hù)生命之光”，專注于為腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療提供具有臨床價(jià)值的二代基因測(cè)序（NGS）。公司業(yè)務(wù)及研發(fā)方向主要覆蓋：1）基于NGS的腫瘤患病人群檢測(cè)，6年間，燃石累計(jì)檢測(cè)樣本超過(guò)18.5萬(wàn)例，在中國(guó)擁有最高的市場(chǎng)份額；2）基于NGS的癌癥早檢，目前已經(jīng)進(jìn)入臨床驗(yàn)證階段。燃石醫(yī)學(xué)于2018年7月獲國(guó)家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）頒發(fā)的中國(guó)腫瘤NGS檢測(cè)試劑盒第一證，在體外診斷領(lǐng)域具有里程碑式意義。實(shí)驗(yàn)室獲得廣東省臨檢中心頒發(fā)的“高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)室”技術(shù)審核，以及得美國(guó)CLIA和CAP實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量體系資質(zhì)認(rèn)證。公司將繼續(xù)致力于開(kāi)發(fā)創(chuàng)新可靠的NGS檢測(cè)產(chǎn)品，推動(dòng)腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域的發(fā)展。 |
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來(lái)自： 劉得光3p6n6zqq > 《燃石醫(yī)學(xué)》
