炎癥反應(yīng)（inflammation）是細(xì)胞對(duì)微生物感染、外界刺激以及自身組織損傷做出的復(fù)雜生物學(xué)反應(yīng)，包括疼痛，發(fā)熱，發(fā)紅，發(fā)腫以及組織功能受損等一系列癥狀。

如果你要深入研究驗(yàn)證，那一定繞不開炎癥小體。

關(guān)于炎癥小體，我們?cè)谥暗奈恼轮杏性敿?xì)介紹過，還列舉了一些疾病中它們是如何發(fā)揮作用的，感興趣的小伙伴們可以回顧一下#淺談炎癥小體-Inflammation#

大部分炎癥小體的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)都是以NLR或ALR蛋白家族作為受體蛋白(receptor)、ASC作為接頭蛋白(adaptor)、caspase作為效應(yīng)蛋白(effector)。

炎癥小體結(jié)構(gòu)示意圖

目前研究較多的是NLRP3炎癥小體。

NLRP3炎癥小體由ASC、Caspase-1和NLRP3組成。NLRP3炎癥小體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可表示為：LRR-NACHT-PYD : PYD-CARD : CARD-Caspase。

在研究檢測(cè)NLRP3時(shí)，我們需要提前做好哪些功課，避開雷區(qū)，比較快的得到正確客觀的結(jié)果呢？小優(yōu)整理了以下三點(diǎn)：

01 NLRP3激活途徑

NLRP3的典型途徑 — 炎癥小體激活

炎癥小體激活經(jīng)典途徑描述了巨噬細(xì)胞中 NLRP3 的激活，其中需要兩種刺激。

在靜息狀態(tài)下，NLRP3 和 IL-1β 在細(xì)胞中表達(dá)量處于極低水平，不能用于組裝或活化 NLRP3 炎癥小體。

免疫細(xì)胞需要接受引發(fā)刺激，如脂多糖（LPS）與胞膜上的Toll樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR4）結(jié)合以激活NF-κB，活化的NF-κB進(jìn)一步上調(diào)NLRP3、pro-IL-1β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

高水平的NLRP3、pro-IL-1β mRNA是形成有效炎癥小體的關(guān)鍵，所以我們?cè)谂龅絎B無(wú)條帶的時(shí)候，也可以通過mRNA來確定NLRP3、pro-IL-1β的表達(dá)量。

接受啟動(dòng)信號(hào)后,NLRP3炎癥小體會(huì)因病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)或損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)等多種因素而被激活。

NLRP3結(jié)構(gòu)蛋白的寡聚化作用使其與接頭蛋白ASC的PYD相結(jié)合，然后ASC的CARD與pro-Caspase-1上的CARD結(jié)合，形成完整且有活性的NLRP3炎性小體，促使pro-Caspase-1自我裂解，產(chǎn)生活性的效應(yīng)蛋白Caspase-1。

Caspase-1具有剪切GSDMD的功能，使GSDMD的N末端結(jié)構(gòu)域釋放。N-GSDMD通過與細(xì)胞膜上內(nèi)頁(yè)的磷脂酰絲氨酸和磷酸肌醇結(jié)合，在細(xì)胞膜上打孔，細(xì)胞內(nèi)外失衡而破裂，引起細(xì)胞死亡，細(xì)胞內(nèi)容物釋放到細(xì)胞外，引起炎癥反應(yīng)。

Caspase除了剪切GSDMD，還可以誘導(dǎo)IL-1β和IL-18從未成熟狀態(tài)轉(zhuǎn)化為活性狀態(tài)，細(xì)胞死亡后IL-1β和IL-18會(huì)釋放到細(xì)胞外從而誘發(fā)神經(jīng)炎癥。

ASC、caspase-1的剪切，IL-1β和IL-18的剪切，以及GSDMD的剪切，這些結(jié)果都可以幫助我們判斷NLRP3炎癥小體的激活情況。

doi: 10.1038/s41419-021-03751-3.

以這篇文獻(xiàn)為例，作者通過對(duì)腎小管上皮細(xì)胞HK-2進(jìn)行H/R 模型研究，得出結(jié)論：氧化應(yīng)激上調(diào)的 FIP1 通過誘導(dǎo) 3'UTR 縮短來放大炎癥、纖維化、ROS 產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡。

FIP1 促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的炎癥（文獻(xiàn) Fig 5）

02NLRP3激活途徑  

前面我們提到NLRP3在靜息細(xì)胞中表達(dá)量很低，那是不是未刺激的細(xì)胞就無(wú)法檢測(cè)到WB條帶呢？答案是否定的。

從HPA（The Human protein Atlas）可知NLRP3在血液和免疫細(xì)胞中的基因表達(dá)水平尚可，富集于巨噬細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞、霍夫鮑爾細(xì)胞，但NLRP3多以泛素化無(wú)活性、穩(wěn)定狀態(tài)存在，實(shí)際蛋白水平并不高。

NLRP3在人源細(xì)胞系中的基因表達(dá)水平（HPA）

從BioGPS可知NLRP3在鼠源細(xì)胞系中主要在血液和免疫細(xì)胞上表達(dá)，并可通過適當(dāng)?shù)拇碳ぬ幚恚ㄈ鏛PS）提高其表達(dá)量。

NLRP3在鼠源細(xì)胞系中的基因表達(dá)水平（BioGPS）

NLRP3在樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的表達(dá)較高水平，樣本選擇時(shí)首先需要了解它的表達(dá)情況。若蛋白本身不表達(dá)或表達(dá)量極低，刺激處理也未必能有效提高表達(dá)水平，如何才能有效激活也需要多參考文獻(xiàn)中的條件設(shè)置。

不同樣本及不同處理NLRP3的蛋白表達(dá)情況

03 WB常見問題的優(yōu)化方案

在做Western實(shí)驗(yàn)時(shí)，有的老師可能會(huì)遇到無(wú)條帶、非特異帶、高背景或者條帶位置不對(duì)的情況，針對(duì)這些情況出現(xiàn)的可能原因，小優(yōu)進(jìn)行了一一分析，并給出了相應(yīng)的解決方案。

QUESTION

常見問題原因分析

NO.1 無(wú)條帶：
樣品未經(jīng)合適處理；提取不充分；抗體不工作
 

NO.2 非特異帶：
樣品降解；漂洗不充分；抗體非特異

 
NO.3 高背景：
樣品降解；試劑或操作污染；漂洗不充分；PVDF膜；抗體非特異

NO.4 條帶位置不對(duì)：
樣品降解，膠濃度，抗體非特異
 

如何才能得到一個(gè)漂亮的結(jié)果呢？小優(yōu)為您提供了一些優(yōu)化建議：

01  無(wú)條帶
設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（如小鼠骨髓源性的DC、骨髓源性的巨噬細(xì)胞等）；樣品新鮮制備；裂解時(shí)建議超聲處理；增加上樣量(細(xì)胞20μg，組織50-100μg)；更換抗體。

02 非特異性條帶
新鮮制備樣品；加強(qiáng)漂洗，增加漂洗液中的NaCl 濃度（150mM-500mM）和Tween濃度（0.1-0.5%）；更換抗體。

03 高背景
新鮮制備樣品；實(shí)驗(yàn)中試劑包括電泳液、轉(zhuǎn)膜液、漂洗液、脫脂奶粉、抗體稀釋液等用新鮮配制的，使用干凈的海綿、新的濾紙，操作時(shí)用鑷子夾邊緣不要用手觸摸，孵育時(shí)放平、均勻孵育，保持膜的濕潤(rùn)；加強(qiáng)漂洗，增加漂洗液中的NaCl和Tween濃度；換用NC膜；更換抗體。

04 條帶位置不對(duì)
新鮮制備樣品；使用梯度膠，排查問題時(shí)孵全膜；更換抗體。

小優(yōu)Tips
裂解后對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行超聲，目的在于確保膜的充分剪切，并通過斷裂染色質(zhì)，提高蛋白的可溶性，幫助徹底裂解樣本，減少拖帶。

超聲步驟為冰上3 X 5 second bursts at 50% output。如沒有超聲儀，可用1ml注射器針頭，冰上反復(fù)抽打裂解液10次左右，達(dá)到類似于超聲的效果。

 
裂解物超聲效果

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