2014年，國際上開始報告使用mNGS診斷神經(jīng)感染病例^[1]。2015年以來，腦脊液 mNGS在國內(nèi)逐漸應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的診斷^[2]。此后，國內(nèi)外開展了一系列隊列研究^[5?9]，報告腦脊液mNGS檢出致病病原體的比例為15.7%~ 57.0%；在神經(jīng)感染病例中，mNGS與傳統(tǒng)病原學(xué)技術(shù)同時陽性的比例為22.5%~52.6%；此外，一項非前瞻性研究結(jié)果顯示，腦脊液mNGS在腦炎與腦膜炎診斷中的敏感度為73%，特異度為 99%^[10]；充分說明了腦脊液mNGS 對CNS感染性疾病病原診斷的實用性。我國在使用 mNGS 診斷神經(jīng)感染的技術(shù)進(jìn)展上與世界同步^[11]。

（一）腦脊液mNGS適應(yīng)證

腦脊液 mNGS 主要適用于懷疑CNS感染性疾病患者的致病性病原體鑒定，包括病因未明的腦炎、腦膜炎(包括腦炎與腦膜炎疊加的腦膜腦炎)和腦膿腫等疾病的患者。

（二）腦脊液mNGS送檢時機(jī)

對于社區(qū)獲得性急性腦炎和腦膜炎，非重癥患者一般可以先開展腦脊液傳統(tǒng)微生物學(xué)檢查，仍不能明確病因時再送檢腦脊液 mNGS；必要時在首次留取腦脊液時預(yù)先將 2~5 ml 腦脊液標(biāo)本保存于-20 ℃冰箱，若經(jīng)過腦脊液傳統(tǒng)微生物學(xué)檢查在3 d內(nèi)未獲得明確的病原學(xué)證據(jù)且經(jīng)驗性抗感染治療無效，建議對預(yù)留的腦脊液標(biāo)本進(jìn)行 mNGS 檢測。對重癥患者建議首次腦脊液檢查即送檢mNGS；對于高度懷疑新發(fā)病原體^[12?13]、罕見病原體感染，而臨床缺乏其他可及的檢測方法時，建議首次腦脊液檢查即送檢腦脊液 mNGS。對于醫(yī)院獲得性急性腦炎和腦膜炎，若經(jīng)過包括腦脊液傳統(tǒng)微生物學(xué)檢查在內(nèi)的系統(tǒng)性檢查（影像學(xué)檢查、實驗室檢查）仍未能明確病因，且患者接受經(jīng)驗性治療后無顯著好轉(zhuǎn)，建議復(fù)查腦脊液，并送檢mNGS。

對于病因不明的慢性CNS感染性疾病患者，例如病因未明的慢性腦膜炎患者，首選腦脊液mNGS進(jìn)行檢測^[14?15]。

對于原發(fā)性免疫缺陷、粒細(xì)胞缺乏、艾滋病、服用免疫抑制劑等免疫功能缺陷的患者，由于病情復(fù)雜、進(jìn)展快、潛在的病原體種類繁多、存在新發(fā)病原體可能，建議首次腦脊液檢查即送檢mNGS^[16?17]。

臨床懷疑CNS感染患者的標(biāo)本一般送檢病原微生物DNA檢測；若臨床高度懷疑RNA病毒感染，例如不明原因的基底節(jié)腦炎，則需要加送病原微生物RNA檢測，但RNA病毒的腦脊液 mNGS 陽性率較低^[14]。

標(biāo)本的質(zhì)量直接影響檢測結(jié)果及其同臨床診斷的符合度，是mNGS病原學(xué)診斷的關(guān)鍵因素。標(biāo)本管理相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序和標(biāo)本采集手冊應(yīng)該由實驗室工作人員和臨床醫(yī)生共同討論確定。

（一）標(biāo)本類型

本共識主要基于腦脊液標(biāo)本。在腦脊液標(biāo)本檢測結(jié)果不能輔助診斷或者不能獲得腦脊液標(biāo)本，但是又高度懷疑CNS感染時，建議采集腦組織活組織檢查（活檢）標(biāo)本或者血液標(biāo)本送檢，具體送檢流程可以咨詢檢測機(jī)構(gòu)。

（二）標(biāo)本信息

送檢標(biāo)本應(yīng)有送檢申請表，填寫受檢者信息，包括標(biāo)本唯一性編碼、采樣日期、采樣時間、患者個人基本信息、標(biāo)本組織類型、采樣單位和臨床資料等。收集標(biāo)本的容器上應(yīng)注明患者的唯一信息，通?？砂z測編碼、受檢者的姓名、送檢科室和住院號等信息。醫(yī)護(hù)人員在采樣前需仔細(xì)核對患者信息。

（三）知情同意

標(biāo)本采集前主管醫(yī)生應(yīng)向患者或其監(jiān)護(hù)人或者委托人告知所檢測項目的目的、總體陽性率、優(yōu)點和局限性（有限的特異度與敏感度，可能出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果）、費用（包括是否為自費）、預(yù)期報告時間、剩余標(biāo)本的去向及保存時間、臨檢標(biāo)本是否可匿名用于科研項目等，并告知mNGS以外的其他可選檢驗項目，以獲得知情同意。在整個流程中，要注意保護(hù)患方的個人隱私。

（四）標(biāo)本采集

腦脊液標(biāo)本采集可以按照臨床腰椎穿刺常規(guī)操作方法。為減少標(biāo)本采集時的微生物污染，應(yīng)使用嚴(yán)格的無菌技術(shù)，采集腦脊液時要充分消毒穿刺點及周圍皮膚^[18]。盡量避免腦脊液標(biāo)本中混入血液。建議送檢第2管或者第2管之后的標(biāo)本，送檢量2~5ml，送檢前盡量減少對標(biāo)本的額外分裝^[18]。

（五）標(biāo)本保存和運輸

標(biāo)本保存管應(yīng)無菌、無消毒劑及防腐劑、無污染、密封性好、材質(zhì)透明以便于觀察。標(biāo)本采集后需要采用冷鏈運輸；采集后4h內(nèi)開始檢測的標(biāo)本在2~8 ℃保存和運輸；間隔時間長于4h短于1周的標(biāo)本在-20℃以下保存，干冰運輸；間隔時間長于1周的標(biāo)本建議低于-70℃保存；標(biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融，運輸時避免劇烈震動^[18?19]。標(biāo)本采集后應(yīng)及時送檢，轉(zhuǎn)運標(biāo)本時，應(yīng)按照國家有關(guān)生物安全標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)識、包裝標(biāo)本，運送過程符合生物安全規(guī)范的要求，嚴(yán)防外部微生物污染標(biāo)本，同時要防止標(biāo)本內(nèi)容物泄漏污染環(huán)境。

（六）檢測與報告

腦脊液 mNGS檢測過程包括標(biāo)本處理、核酸提取、文庫制備、上機(jī)測序、數(shù)據(jù)處理、序列比對、人源序列去除、微生物注釋和報告^[3]。整個檢測體系應(yīng)該有完整的質(zhì)量控制方案和參數(shù)，用于比對和注釋的病原微生物數(shù)據(jù)庫應(yīng)該盡量完整、精確并定期更新，并需要對檢測流程的分析性能進(jìn)行確認(rèn)，以保證檢測報告的準(zhǔn)確性^{[10，20?22]}。

mNGS 病原檢測報告需要符合《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實驗室管理辦法(衛(wèi)醫(yī)發(fā)〔2006〕73號)》和《醫(yī)學(xué)檢驗實驗室基本標(biāo)準(zhǔn)和管理規(guī)范(試行)國衛(wèi)醫(yī)發(fā)〔2016〕37 號》對檢測報告的要求，列出患者信息、標(biāo)本信息、檢測方法、檢測范圍、結(jié)果、檢測機(jī)構(gòu)與報告人信息等內(nèi)容。檢測報告需要有嚴(yán)格的發(fā)放和審核流程，以確保報告的及時、有效、正確和完整。

報告應(yīng)該列出微生物的特異性序列數(shù)，在此基礎(chǔ)上建議列出基因組覆蓋度、相對豐度等指標(biāo)，或者列出綜合多種指標(biāo)的參數(shù)并加以解釋（例如置信度）。特異性序列是指唯一匹配到某種微生物基因組的核苷酸序列，其檢出數(shù)量會受到微生物基因組大小、測序策略、標(biāo)本中微生物載量及其核酸提取難易程度、標(biāo)本中人源核酸比例等因素的影響。

報告的微生物應(yīng)該是符合陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)(即高于報告閾值)的微生物，具體的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)難以統(tǒng)一，可以在確定測序平臺、檢測流程、數(shù)據(jù)庫和生物信息分析方法后進(jìn)行設(shè)置。

（七）實驗室質(zhì)控

mNGS 檢測主要包括實驗操作與生物信息學(xué)分析兩部分。實驗室應(yīng)建立室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序(standard operating procedure）及質(zhì)量管理體系，并定期參加室間質(zhì)評與能力驗證，并有持續(xù)的質(zhì)量保證和改進(jìn)計劃^[23?24]。

臨床需要綜合流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)、影像學(xué)、腦脊液學(xué)與血清學(xué)等檢查結(jié)果，對腦脊液mNGS檢測報告進(jìn)行解讀，盡量充分利用傳統(tǒng)的微生物鑒定方法驗證mNGS結(jié)果。陽性結(jié)果解讀需要關(guān)注：微生物是否具有人類神經(jīng)系統(tǒng)侵襲性(嗜神經(jīng)性)的生物學(xué)特征，患者臨床表現(xiàn)是否和微生物的致病特性一致，報告微生物是否和其他病原學(xué)檢查結(jié)果一致。

（一）陽性結(jié)果的解讀

報告的微生物具有神經(jīng)侵襲性，且與臨床經(jīng)驗診斷相一致，可初步確定其為責(zé)任病原體；腦脊液 mNGS 檢測到肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、單純皰疹病毒(HSV)1型、HSV2型、水痘?帶狀皰疹病毒等病原體時多屬于這種情況^[2，25]。

報告的微生物和傳統(tǒng)微生物檢查結(jié)果一致，表明其在樣本中存在，報告微生物是責(zé)任病原體的可能性很大。

當(dāng)腦脊液中檢出非人體定植菌且環(huán)境中不常見的微生物(例如單核細(xì)胞增生性李斯特菌^[26]、豬帶絳蟲^[27?29]、廣州管圓線蟲^[30?32]、阿米巴^[33?34]等)時，有可能是責(zé)任病原體，因此陽性報告就應(yīng)該考慮其致病可能。

某些微生物(例如結(jié)核分枝桿菌、諾卡菌、某些真菌)的生長特點和結(jié)構(gòu)特點導(dǎo)致其核酸提取的難度較大，檢出的特異性序列數(shù)可能少，因此，陽性報告就應(yīng)該考慮其致病可能^[35?40]；例如，結(jié)核分枝桿菌的特異性序列數(shù)可以低至1個^[37]，隱球菌的特異性序列數(shù)可以低至1~2個^[35，38]，白色念珠菌的特異性序列數(shù)可以低至6個^[7]、單核細(xì)胞增生性李斯特菌可以低至8個^[41]，諾卡菌可以低至12個^[36]。

部分DNA病毒可在CNS潛伏，陽性結(jié)果需要綜合臨床病情來判斷其是潛伏感染、病毒攜帶狀態(tài)還是活動性感染。例如：腦脊液EB病毒核酸陽性，可以見于潛伏感染、活動性感染、EB病毒相關(guān)淋巴細(xì)胞增殖性疾病以及EB病毒感染相關(guān)神經(jīng)免疫性病^[42?45]。

mNGS檢測出陽性微生物但是傳統(tǒng)微生物檢查結(jié)果陰性時，需要根據(jù)檢出微生物致病特性，結(jié)合臨床綜合評估其致病可能。

報告微生物有可能來源于環(huán)境污染或者腰椎穿刺點附近皮膚定植，不同的患者和就診場所其微生物種類不同，臨床醫(yī)生可以和檢測機(jī)構(gòu)溝通確定各自的背景微生物，但是，在人體免疫功能受損時，某些定植微生物也可能是致病菌。

若同一患者的同類標(biāo)本多次送檢，在檢測條件一致的情況下，同一種微生物序列數(shù)的變化可以輔助判斷療效^{[31，44]}。

對于免疫功能缺陷的患者，易發(fā)生CNS機(jī)會性感染(JC病毒、CMV、隱球菌、弓形蟲等)^[46?48]，且臨床表現(xiàn)不典型，要高度重視報告微生物的致病可能。

（二）陰性結(jié)果的解讀

陰性結(jié)果表明所有檢測到的微生物都不符合陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，如果臨床醫(yī)生經(jīng)過綜合評估，對結(jié)果存疑時，可以參考低于檢測閾值的微生物。

腦脊液 mNGS 陰性結(jié)果不能完全排除 CNS感染性疾??；當(dāng)腦脊液 mNGS 檢測結(jié)果為陰性時，首先排除因標(biāo)本采集、運輸和保存不當(dāng)而造成的假陰性，如果臨床仍懷疑 CNS 感染性疾病，可復(fù)查傳統(tǒng)病原學(xué)檢測，或者擴(kuò)大病原體鑒別診斷的范圍，尤其是對mNGS檢測相對不敏感的病原體（如結(jié)核分枝桿菌和乙型腦炎病毒等），必要時再次送檢mNGS，可考慮送檢獨立第三方檢測機(jī)構(gòu)。

腦脊液微生物 DNA檢測結(jié)果為陰性時需要考慮 RNA 病毒感染的可能，例如流行性乙型腦炎和新型布尼亞病毒腦炎等，建議送檢腦脊液微生物RNA 檢測，并送檢 RNA 病毒相關(guān)的抗體檢測和PCR檢測。

腦脊液 mNGS結(jié)果為陰性時，臨床應(yīng)關(guān)注非感染性病因的可能性，包括自身免疫性腦炎、腫瘤、CNS 血管性疾病等，進(jìn)一步完成相關(guān)檢查與鑒別診斷。

若患者近期內(nèi)曾有 mNGS檢測陽性結(jié)果，在綜合臨床病情的基礎(chǔ)上，同種標(biāo)本相同病原體的復(fù)檢陰性結(jié)果可能提示臨床治療有效^[7,40,49]。

（三）腦脊液mNGS檢測后的臨床應(yīng)對措施

對于確定的責(zé)任病原體，則展開針對性的目標(biāo)治療，如果已有經(jīng)驗性抗感染治療用藥，責(zé)任病原體和預(yù)期判斷不同的則更換藥物或者停藥，和預(yù)期判斷一致的則可以繼續(xù)相關(guān)治療或降階梯治療；后續(xù)治療如果效果差，需要考慮病原體耐藥、基礎(chǔ)疾病、藥物劑量等原因。

臨床懷疑 mNGS為假陽性結(jié)果時，則需要根據(jù)不同病原體鑒定的具體方法，選用一代測序、抗體或者抗原血清學(xué)檢測、培養(yǎng)、腦脊液細(xì)胞學(xué)和腦活檢病原體染色等技術(shù)，進(jìn)行進(jìn)一步驗證；對于檢出的罕見微生物，需要查閱文獻(xiàn)，從各方面綜合判斷證實其致病性；仍不能驗證或者排除的，可以進(jìn)行診斷性治療。

對于mNGS首次在人體標(biāo)本中檢測到的動物源性微生物，要高度重視其作為人類新發(fā)CNS感染性疾病病原體的可能，綜合臨床流行病學(xué)調(diào)查、臨床表現(xiàn)、病原學(xué)驗證(核酸檢測、抗原抗體檢測、病理學(xué)檢查、病原分離培養(yǎng)、動物接種等)等結(jié)果來判斷，必要時需要上報疾病預(yù)防控制中心等管理部門。

如果 mNGS檢測結(jié)果陰性，但檢測之前的經(jīng)驗性抗感染治療有效，則不能因為mNGS陰性結(jié)果而終止有效的經(jīng)驗性抗感染治療。

對于 mNGS 檢測結(jié)果和臨床表現(xiàn)不符合的患者，需要評估患者的免疫功能是否受損，送檢外周血淋巴細(xì)胞亞群和免疫球蛋白等，協(xié)助判斷是否是致病微生物。

經(jīng)過不斷的技術(shù)優(yōu)化、臨床應(yīng)用研究與經(jīng)驗積累，腦脊液mNGS已經(jīng)成為CNS感染病原學(xué)鑒定的重要實用技術(shù)^[50]。我們希望本共識能夠幫助臨床醫(yī)生更合理、更規(guī)范地應(yīng)用腦脊液mNGS并解讀檢測結(jié)果，提升mNGS在CNS感染中應(yīng)用的精準(zhǔn)性^[20]。針對不同的患者和標(biāo)本特點采用不同的檢測流程并標(biāo)準(zhǔn)化，根據(jù)不同醫(yī)院的微生物分布特點實施不同的分析策略，可能是未來CNS感染精準(zhǔn)病原學(xué)檢測的方向，學(xué)組也將持續(xù)開展腦脊液mNGS研究，總結(jié)研究成果，跟進(jìn)國內(nèi)外研究進(jìn)展，適時更新共識。

參考文獻(xiàn)略。