【原】詳談血細胞計數(shù)板

生物學(xué)教學(xué) 2021-11-26

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詳談血細胞計數(shù)板使用方法

1 血球計數(shù)板的構(gòu)造

血細胞計數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，玻片中有4 條凹槽，構(gòu)成了3 個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽隔為兩半，每半邊上面各有一個方格網(wǎng)，即計數(shù)區(qū)，計數(shù)區(qū)被分成9個大方格，其中只有中間的一個大方格為計數(shù)室，如圖1。故每一塊血細胞計數(shù)板中間平臺上有2個計數(shù)室。

圖1 血細胞計數(shù)板（左）；16×25規(guī)格的計數(shù)室（右）

2 血球計數(shù)板的規(guī)格

酵母菌數(shù)量動態(tài)變化探究活動中蘇教版推薦使用規(guī)格為1mm×1mm×0.1mm的血球計數(shù)板；人教版、浙科版高中生物教材推薦使用規(guī)格為2mm×2mm×0.1mm的血球計數(shù)板。前者在實驗活動中更為常見。這兩種技術(shù)室的容積分別為0.1mm³（1×10^-4mL）和0.4mm³（4×10^-4mL）。每種規(guī)格的計數(shù)室通常又有兩種規(guī)格：一種是16×25 型，即大方格內(nèi)分為16個中格，每一中格又分為 25小格；另一種是25×16 型，即大方格內(nèi)分為 25中格，每一中格又分為 16 小格。但是，不管計數(shù)室是哪一種型號規(guī)格，計數(shù)室都是由400個小方格組成（如圖2）。

圖2 兩種規(guī)格的計數(shù)室放大后的圖像

3 加樣

血球計數(shù)板的結(jié)構(gòu)及原理與普通的載玻片不同，因此加樣及蓋蓋玻片也有特定的操作要求，人教版教材建議：“先將蓋玻片放在計數(shù)室上，用吸管吸取培養(yǎng)液，滴于蓋玻片邊緣，讓培養(yǎng)液自行滲入，多余的培養(yǎng)液用濾紙吸去?！闭憧瓢姹匦奕袇s描述為：“用滴管從試管中取1滴培養(yǎng)液到血細胞計數(shù)板的方格區(qū)，蓋上蓋玻片^[1]”。浙科版學(xué)生實驗手冊中的操作方法與人教版的描述一致^[2]。其實不論是先加樣后蓋蓋玻片，還是蓋蓋玻片再加樣，理論上都行的通，但是對前者的液滴量的要求較高，蓋蓋玻片時也容易產(chǎn)生氣泡。因此為了更準確地計數(shù)及成功率角度方面說，應(yīng)先蓋蓋玻片再加樣。

4 血球計數(shù)板的計數(shù)

4.1 用1mm×1mm×0.1mm，16×25規(guī)格或25×16的計數(shù)室 加樣后，稍待片刻，待細胞全部沉降到技術(shù)室底部后，將計數(shù)板放于載物臺中央，尋找技術(shù)室，取計數(shù)室的左上、右上、右下、左下4個中格（即對應(yīng)圖2中1、4、16、13四個中格，共計100個小格）進行計數(shù)。計數(shù)重復(fù)3次，算出每個小格內(nèi)細胞數(shù)目的平均值。計算公式為：細胞個數(shù)/1mL=100個小方格細胞數(shù)×400×10⁴×稀釋倍數(shù)；若用1mm×1mm×0.1mm，25×16規(guī)格的計數(shù)室，加樣后，在計數(shù)室的左上、右上、右下、左下和中部的5個中格（即對應(yīng)圖2中1、5、25、21、13五個中格，共計80個小格子）進行計數(shù)。計數(shù)重復(fù)3次，算出每個小格內(nèi)細胞數(shù)目的平均值。計算公式為：細胞個數(shù)/1mL=每個小格內(nèi)細胞的平均值×400×10⁴×稀釋倍數(shù)（公式推導(dǎo)如圖3）

4.2 用2mm×2mm×0.1mm，16×25或25×16規(guī)格的計數(shù)室 加樣后，稍待片刻，待細胞全部沉降到技術(shù)室底部后，將計數(shù)板放于載物臺中央，尋找技術(shù)室，取計數(shù)室的左上、右上、右下、左下4個中格（即對應(yīng)圖2中1、4、16、13四個中格，共計100個小格）進行計數(shù)。計數(shù)重復(fù)3次，算出每個小格內(nèi)細胞數(shù)目的平均值。計算公式為：細胞個數(shù)/1mL=每個小格內(nèi)細胞數(shù)目的平均值×400×2.5×10³×稀釋倍數(shù)；若用2mm×2mm×0.1mm，25×16規(guī)格的計數(shù)室，加樣后，在計數(shù)室的左上、右上、右下、左下和中部的5個中格（即對應(yīng)圖2中1、5、25、21、13五個中格，共計80個小格子）進行計數(shù)。計數(shù)重復(fù)3次，算出每個小格內(nèi)細胞數(shù)目的平均值。計算公式為：細胞個數(shù)/1mL=每個小方格細胞數(shù)目的平均值×400×2.5×10³×稀釋倍數(shù)（公式推導(dǎo)如圖3）

圖3 1mL內(nèi)細胞個數(shù)的推導(dǎo)公式

備注：上述公式推導(dǎo)中，每個小格內(nèi)細胞平均數(shù)是指：16×25規(guī)格通過100個小格計算出的每個小格內(nèi)細胞平均數(shù)；或25×16規(guī)格，通過80個小格計算出的每個小格細胞平均數(shù)。

5 典型例題

在探究培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量變化的實驗中，利用1mm×1mm×0.1mm，25×16規(guī)格計數(shù)板對微生物細胞進行直接計數(shù)，如下圖。某同學(xué)操作時將1mL 酵母菌樣品加 99mL無菌水稀釋，用無菌吸管吸取少許使其自行滲入計數(shù)室，蓋上蓋玻片并用濾紙吸去多余菌液，進行觀察計數(shù)?；卮鹣铝袉栴}：

（1）在實驗中，某學(xué)生的部分實驗操作過程是這樣的：①從靜置試管中吸取酵母菌培養(yǎng)液加入計數(shù)板進行計數(shù)，記錄數(shù)據(jù)；②把酵母菌培養(yǎng)液放置在冰箱中；③第七天再取樣計數(shù)，記錄數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析繪成曲線。請指出該同學(xué)實驗操作中的 3 處錯誤并改正：①應(yīng)將試管輕輕震蕩幾次再吸取酵母菌培養(yǎng)液進行計數(shù)；②應(yīng)將酵母菌培養(yǎng)液放置在適宜溫度下培養(yǎng)；③應(yīng)連續(xù)七天，每天觀察、取樣計數(shù)并記錄數(shù)據(jù)。

（2）在實驗前應(yīng)該對計數(shù)板、吸管等器具進行滅菌處理。

（3）如果一個小方格內(nèi)酵母菌過多，難以數(shù)清，應(yīng)采取的措施是稀釋處理。

（4）如果觀察到上圖所示 a、b、c、d、e 5 個中格內(nèi)共有酵母菌 48 個，則上述 1mL 酵母菌樣品中約有酵母菌2.4×10⁸個；要獲得較為準確的數(shù)值，減少誤差，你認為該怎么做？多次計數(shù)，求平均值。

（5）計數(shù)完畢，取下蓋玻片，用清水將血球計數(shù)板沖洗干凈，不能（填寫能或不能）用硬物洗刷。

解析：（1）①應(yīng)將試管輕輕震蕩幾次再吸取酵母菌培養(yǎng)液進行計數(shù)②應(yīng)將酵母菌培養(yǎng)液放置在適宜溫度下培養(yǎng)③應(yīng)連續(xù)七天，每天觀察、取樣計數(shù)并記錄數(shù)據(jù)

（2）為了保證計數(shù)準確，不受其它雜菌的影響，應(yīng)該滅菌處理。

（3）如果小格內(nèi)酵母菌較多，應(yīng)該稀釋處理。

（4）如題，所用規(guī)格為1mm×1mm×0.1mm，25×16的計數(shù)板，所以a、b、c、d、e 5 個中格內(nèi)共計80個小格內(nèi)含有48個酵母菌。那么計數(shù)室內(nèi)400個小格，酵母菌的數(shù)量為240個，即0.1mm³內(nèi)含有240個酵母菌，又因為計數(shù)前酵母菌液稀釋了100倍。因此可以推算出1mL內(nèi)含有2.4×10⁸個酵母菌。其實也可以用上文提到的公式直接帶入計算:細胞個數(shù)/1mL=每個小方格細胞數(shù)目的平均值×400×10⁴×稀釋倍數(shù)=48/80×400×10⁴×100=2.4×10⁸。要獲得較為準確的數(shù)值，減少誤差，多次計數(shù)，求平均值。

（5）為防止硬物洗刷或抹擦損壞計數(shù)室網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或吹風(fēng)機吹干，放入盒內(nèi)保存。

6 血球計數(shù)板使用注意事項

（1）血球計數(shù)板計數(shù)法的缺點是不能區(qū)分死菌和活菌，因此計數(shù)結(jié)果與待測樣品中實際含菌數(shù)量相比往往偏高。為了避免把死菌計數(shù)在內(nèi)，可以對待測菌體用臺盼藍染色，被染成藍色的，為死菌。反之，為活菌；

（2）應(yīng)將試管輕輕震蕩或倒轉(zhuǎn)幾次再吸取酵母菌培養(yǎng)液進行計數(shù)；

（3）若培養(yǎng)一段時間后而密度過大，計數(shù)前要進行稀釋一定的倍數(shù)；

（4）壓在方格線上的細胞只計左線和上線的細胞，目的是防止重復(fù)計數(shù)；

（5）酵母細胞若有黏連，要數(shù)出團塊中的每一個細胞；

（6）出芽酵母的芽體體積若超過細胞體積的1/2，則算作獨立的個體；

（7）計數(shù)總數(shù)不少于300個細胞；

（8）計數(shù)時應(yīng)不時地調(diào)節(jié)焦距，才能觀察到不同深度的菌體。

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