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近日，美國(guó)布蘭代斯大學(xué)Piali Sengupta和Michael P. O’Donnell研究小組發(fā)現(xiàn)，腸道細(xì)菌產(chǎn)生的神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)宿主的感覺行為（DOI:10.1038/s41586-020-2395-5）。相關(guān)論文于2020年6月17日在線發(fā)表在《自然》雜志上。該研究結(jié)果表明，腸道細(xì)菌產(chǎn)生的神經(jīng)遞質(zhì)模擬了同源宿主分子的功能從而越過宿主調(diào)控感覺決定，這促進(jìn)了宿主和微生物的適應(yīng)性。 
動(dòng)物與包括微生物在內(nèi)的多種生物體存在互惠共生關(guān)系。過去認(rèn)為一些細(xì)菌產(chǎn)生的具有生物活性的神經(jīng)遞質(zhì)可以調(diào)節(jié)其宿主的神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)和行為。然而這種“微生物-腦”的信號(hào)傳輸機(jī)制和它的生理相關(guān)性在很大程度上是未知的。在這篇文章中，研究人員通過使用秀麗隱桿線蟲為模式生物，結(jié)果顯示在腸道內(nèi)定居共生菌普羅維登斯細(xì)菌產(chǎn)生的神經(jīng)調(diào)節(jié)劑酪胺，繞過了宿主酪胺生物合成的要求并操縱了宿主的感覺行為。細(xì)菌產(chǎn)生的酪胺大概率被宿主酪胺β羥化酶轉(zhuǎn)化為章魚胺。反過來，章魚胺靶向ASH傷害感受神經(jīng)元上的OCTR-1章魚胺受體以調(diào)節(jié)厭惡性嗅覺反應(yīng)。研究人員確定了普羅維登斯細(xì)菌酪胺生物合成所需的基因，并表明這些基因?qū)τ谡{(diào)節(jié)宿主行為是必需的。而在普羅維登斯菌的定殖實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，秀麗隱桿線蟲在進(jìn)行食物選擇時(shí)，優(yōu)先選擇這類細(xì)菌，這種選擇偏好性需要細(xì)菌產(chǎn)生的酪胺和宿主章魚胺信號(hào)。結(jié)果表明，腸道細(xì)菌產(chǎn)生的神經(jīng)遞質(zhì)模仿宿主同源分子的功能，以超越宿主對(duì)感覺決定的控制，從而促進(jìn)宿主和微生物的適應(yīng)性。
背景 腸道定植細(xì)菌和宿主神經(jīng)系統(tǒng)之間的化學(xué)溝通的調(diào)節(jié)途徑大部分還是未知的。秀麗隱桿線蟲是近年來出現(xiàn)的一種研究宿主-微生物化學(xué)溝通的強(qiáng)大實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。野外線蟲的主要食物來源于其腸道內(nèi)定殖的不同的致病菌和非致病菌菌群。接觸致病菌會(huì)改變秀麗隱桿線蟲的嗅覺行為，但腸道內(nèi)的共生菌是否也能調(diào)節(jié)宿主行為還不清楚。 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 線蟲的制備: 所有的實(shí)驗(yàn)都使用的雌雄同體的秀麗隱桿線蟲，所有應(yīng)用于線蟲的菌株都保持在在NGM平板上20℃條件下。分別以10 ng/μl注射SRV-11p：：octR-1(PMOD110)和SRG-47p：：ocTR-1(PMOD111)質(zhì)粒。以20 ng/μl注射tbh-1p：：tbh-1a：：sL2：：mCherry(PMOD115)質(zhì)粒。以30 ng/μl注射UNC-122p：：mCherry共注射標(biāo)記，獲得轉(zhuǎn)基因菌株。接著將線蟲培養(yǎng)在NGM平板上，以獲得不同細(xì)菌型或基因型的線蟲。 主要的實(shí)驗(yàn)： 長(zhǎng)時(shí)程趨化實(shí)驗(yàn)和短時(shí)程趨化實(shí)驗(yàn)分別用于分析線蟲對(duì)食物和環(huán)境選擇的偏好性。響應(yīng)1-辛醇和2-壬酮的SOS分析用于測(cè)定其對(duì)100%1-辛醇和100%2-壬酮的反應(yīng)。腸道細(xì)菌細(xì)胞的量化、定量測(cè)定腸道菌落形成單位、熒光強(qiáng)度測(cè)量反應(yīng)了細(xì)菌的變化趨勢(shì)。通過細(xì)菌宏基因組測(cè)序得到的組裝序列，使用普羅維登斯菌株JUb39 的TyrDC和adcA基因序列blastp比對(duì)至Nr數(shù)據(jù)庫(kù)初始篩選，然后以糞腸球菌TyrDC和線蟲tdc-1基因組序列作為tblastn搜索查詢序列，最后使用從這些tblastn查詢得到的氨基酸序列構(gòu)建最終的系統(tǒng)發(fā)育樹。Metaboseek MS分析軟件分析高效液相色譜質(zhì)譜法數(shù)據(jù)，并集成代謝網(wǎng)絡(luò)分析。所有的統(tǒng)計(jì)分析都是在原始的、非歸一化的數(shù)據(jù)上進(jìn)行的。 主要結(jié)果： 
1腸道細(xì)菌改變宿主嗅覺行為。普羅維登斯菌定殖于秀麗隱桿線蟲腸道內(nèi)，定植程度與對(duì)辛醇的回避行為正相關(guān)。 注：以下的辛醇調(diào)節(jié)表示為對(duì)辛醇的回避行為減少的現(xiàn)象 a. 在長(zhǎng)時(shí)程趨化實(shí)驗(yàn)分析中，秀麗隱桿線蟲與這些指定的細(xì)菌菌株共培養(yǎng)，對(duì)一組有吸引力的揮發(fā)性氣味表現(xiàn)出強(qiáng)烈的吸引力?？v坐標(biāo)的chemotaxis index表示趨化指數(shù)，在辛醇（1-octanol）和壬酮（2-nonanone）的實(shí)驗(yàn)中，與在大腸桿菌OP50菌株共培養(yǎng)的線蟲相比，與普羅維登斯JUb39菌株共培養(yǎng)導(dǎo)致線蟲對(duì)辛醇的回避行為減少，但對(duì)壬酮的回避行為不減少。 b.c. Modulation index表示線蟲對(duì)100%辛醇的調(diào)節(jié)指數(shù)。Dead指用慶大霉素預(yù)處理過的細(xì)菌。PYb007指從堆肥中的線蟲中分離出來的與普羅維登斯JUb39菌株有較遠(yuǎn)親緣關(guān)系的 Providencia Rettgeri菌株?；疑摼€指在辛醇環(huán)境下生長(zhǎng)的線蟲與在不同環(huán)境下獨(dú)立生長(zhǎng)的線蟲的對(duì)照。正值表示辛醇回避減少。使用慶大霉素預(yù)處理過JUb39菌株喂食線蟲可以消除辛醇調(diào)節(jié)。而線蟲必須攝取活的JUb39菌株才能誘導(dǎo)辛醇調(diào)節(jié)。 d.在成年線蟲的后腸中使用紅色熒光蛋白mCherry標(biāo)記細(xì)菌。箭頭指示完好的細(xì)胞。星號(hào)指示漫反射腸道熒光。虛線指示腸邊界。喂食OP50的成蟲的腸道只顯示彌漫的腸道熒光而喂食JUb39菌株的成蟲腸道內(nèi)通常含有大量完整的桿狀細(xì)胞，表達(dá)mCherry。JUb39細(xì)菌傾向于富集在后腸，此外被JUb39菌株定植的線蟲沒有表現(xiàn)出病原性感染的表型特征（如肛門腫脹），進(jìn)一步證實(shí)JUb39菌株對(duì)線蟲基本無(wú)致病性 g.在OP50或JUb39菌株環(huán)境下生長(zhǎng)的年輕成蟲的頭部神經(jīng)元tph-1p::GFP的熒光報(bào)告基因檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)tph-1p::GFP的表達(dá)沒有明顯變化。且a圖中線蟲在細(xì)菌含量較低的食物來源B. megaterium菌中的生長(zhǎng)并沒有改變辛醇調(diào)節(jié)。由此推斷普羅維登斯菌對(duì)辛醇的調(diào)節(jié)不太可能是由于攝食狀態(tài)的改變。 e.被喂食指定菌株生長(zhǎng)的線蟲的腸道細(xì)菌載量。點(diǎn)表示10條線蟲的菌落形成單位中的細(xì)菌載量。在喂食JUb39菌株的線蟲可以分離出大量的細(xì)菌菌落，但在喂食OP50菌株的線蟲不能分離出大量的細(xì)菌菌落。這表明JUb39菌株很可能活在線蟲腸道中。 f.在趨化試驗(yàn)中， 朝1-Octanol(100%辛醇)方向的線蟲始終含有更多的腸道細(xì)菌。括號(hào)中的數(shù)字表示線蟲的數(shù)量。 2. 發(fā)現(xiàn)了一種可能性即線蟲產(chǎn)生的章魚胺，而不是酪胺，其對(duì)于JUb39菌株介導(dǎo)的辛醇調(diào)節(jié)是必要的。細(xì)菌產(chǎn)生的酪胺在功能上補(bǔ)充了宿主衍生的酪胺在驅(qū)動(dòng)感覺行為決定方面的損失。 
a.線蟲體內(nèi)酪胺（TA）和章魚胺（OA）的生物合成。酪胺通過酪胺β-羥化酶(由TBH-1編碼)轉(zhuǎn)化為章魚胺。 b.線蟲對(duì)100%辛醇的調(diào)節(jié)指數(shù)。括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示至少3個(gè)獨(dú)立日內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立化驗(yàn)的次數(shù)。發(fā)現(xiàn)在JUb39菌株環(huán)境下生長(zhǎng)的tdc-1和tbh-1突變體線蟲都表現(xiàn)出辛醇調(diào)節(jié)，但tbh-1突變體線蟲表現(xiàn)出的辛醇調(diào)節(jié)減弱。cat-2和tph-1的突變并不影響辛醇調(diào)節(jié)。WT表示野生型。 c.短程急性回避行為試驗(yàn)SOS分析。評(píng)估辛醇反應(yīng)的單胺能調(diào)節(jié)。 
d.g.使用SOS分析進(jìn)行了所有的辛醇行為實(shí)驗(yàn)。 d圖中OP50菌株環(huán)境下生長(zhǎng)的tdc-1突變線蟲比野生型線蟲對(duì)30%辛醇的反應(yīng)更快，但在JUb39菌株環(huán)境下受到抑制。 g圖中tbh-1的突變完全抑制了辛醇的調(diào)節(jié)，而tdc-1突變的線蟲對(duì)辛醇的調(diào)節(jié)一如既往。此外tdc-1和tbh-1雙突變線蟲的辛醇回避行為與只有tbh-1突變的線蟲相似。這些結(jié)果表明，缺乏宿主來源的章魚胺是tbh-1突變線蟲辛醇調(diào)節(jié)減少的原因。紅色的P值指示指定基因型對(duì)JUb39菌效應(yīng)大小的影響。 
e.f. HPLC-MS進(jìn)行代謝組成分析和N-琥珀酰酪氨酸的定量分析。喂食OP50菌株的tdc-1突變線蟲缺乏N-琥珀酰酪氨酸。而5-羥色胺（N-acetyl serotonin）代謝不變。當(dāng)喂食JUb39菌株時(shí)，這些酪胺衍生的代謝物被恢復(fù)。結(jié)果表示普羅維登斯細(xì)菌與線蟲聯(lián)合產(chǎn)生的酪胺，可以彌補(bǔ)tdc-1突變線蟲內(nèi)源性酪胺產(chǎn)生的不足。 3. 在真核生物和細(xì)菌中，生物胺通常由AADC產(chǎn)生。普羅維登斯細(xì)菌的多個(gè)AADCs產(chǎn)生的酪胺對(duì)于調(diào)節(jié)野生型線蟲回避辛醇的行為是必要的，也是理由充分的。
a.從上至下分別描述了乳桿菌的tryDC位點(diǎn)，Morganella菌的adcA位點(diǎn)，對(duì)JUb39菌株的tyrDC和adcA位點(diǎn)(分別為ΔtyrDC：：cmr和ΔadcA)中設(shè)計(jì)了缺失。革蘭陽(yáng)性菌腸球菌和乳桿菌的酪胺生成主要是通過位于操縱子的兩個(gè)基因tyrDC和tyrP介導(dǎo)的，它們分別編碼AADC tyrDC和酪氨酸通透酶。該操縱子可被l-Tyr誘導(dǎo)。全基因組測(cè)序證實(shí)JUb39菌株和PYb007菌株中均含有tyrDC和tyrP的同源操縱子。在Morganellaceae科的其它成員中也發(fā)現(xiàn)了tyrDC同源物。 b.系統(tǒng)發(fā)育分析。Morganellaceae科的菌株以前曾被報(bào)道在某些條件下產(chǎn)生酪胺，盡管沒有可辨別的tyrDC同源物。但在摩根氏菌中鑒定了一個(gè)編碼AADC的基因(這里命名為adcA)，分別位于編碼Tyt1家族酪氨酸滲透酶基因上游的操縱子中，與tyrDC腸球菌和人類GAD67有大約29%和27%的序列同源性。在普羅維登斯菌基因組中也存在adcA同源物(包括JUb39)，但不與酪氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相鄰。結(jié)論是，普羅維登斯菌編碼至少兩個(gè)可能產(chǎn)生酪胺的AADC，系統(tǒng)發(fā)育不一致提示，摩根科植物中的tyrDC和adcA基因可能都是通過水平基因轉(zhuǎn)移而丟失或獲得的。 c. 以乳桿菌tyrDC的晶體結(jié)構(gòu)為指導(dǎo)進(jìn)行蛋白質(zhì)模擬，結(jié)果表明JUb39 tyrDC與乳桿菌tyrDC具有大多數(shù)已知的催化位點(diǎn)。JUb39 tyrDC在A600處含有一個(gè)替換(乳桿菌tyrDC中的S586)，能增強(qiáng)酪氨酸乳酸桿菌對(duì)酪氨酸的特異性催化活性。由此推測(cè)JUb39 tyrDC可能由酪氨酸產(chǎn)生酪胺。
e.在不同基因型細(xì)菌環(huán)境下生長(zhǎng)的野生型線蟲在NGM+0.5%l-Tyr培養(yǎng)基中生長(zhǎng)期間對(duì)100%辛醇回避行為的SOS測(cè)定。h圖為在此基礎(chǔ)上補(bǔ)充了指定濃度的酪胺。 在單個(gè)細(xì)菌突變體的培養(yǎng)中，辛醇調(diào)節(jié)減弱，而野生型線蟲在雙敲除ΔtyrDC：：cmrΔadca基因JUb39菌株環(huán)境下生長(zhǎng)則取消了辛醇調(diào)節(jié)。 g.f. N-琥珀酰酪胺的含量測(cè)定（f）;（g）檢測(cè)到的其它酪胺衍生物的平均豐度，1指示OP50，2指示JUb59，3指示ΔtyrDC：：CmrΔADCA JUb39。與野生型JUb39相比，比較代謝組學(xué)分析表明，在雙敲除ΔtyrDC：：cmrΔadca基因JUb39菌株環(huán)境下生長(zhǎng)的tdc-1突變線蟲不產(chǎn)生N-琥珀酰酪胺或其他酪胺衍生代謝物。 h.在雙敲除ΔtyrDC：：cmrΔadca基因JUb39菌株環(huán)境下生長(zhǎng)的野生型線蟲在補(bǔ)充酪胺后辛醇調(diào)節(jié)得以恢復(fù)。此外，雖然JUb39菌株環(huán)境下生長(zhǎng)的野生型線蟲不會(huì)因?yàn)檠a(bǔ)充酪胺而增加對(duì)辛醇的回避行為，但補(bǔ)充酪胺足以誘導(dǎo)在OP50菌株環(huán)境下生長(zhǎng)的野生型線蟲的辛醇調(diào)節(jié)。 4. 普羅維登斯細(xì)菌的酪胺靶向感覺神經(jīng)元。線蟲頭部?jī)蓷鞴僦械碾p側(cè)ASH傷害性神經(jīng)元表達(dá)多種酪胺和章魚胺受體，這些單胺對(duì)辛醇的調(diào)節(jié)需要一部分受體。普羅維登斯細(xì)菌酪胺的產(chǎn)生和宿主章魚胺的信號(hào)都是發(fā)生食物偏好所必需的。
a. SOS測(cè)定。在ASH神經(jīng)元表達(dá)的章魚胺受體編碼基因中，octr-1而不是ser-3的突變?cè)诓桓淖兡c道定植的程度下取消了JUb39菌株介導(dǎo)的辛醇調(diào)節(jié)。但在ASH神經(jīng)元表達(dá)的octr-1互補(bǔ)DNA完全恢復(fù)了辛醇調(diào)節(jié)。 b. SOS測(cè)定。當(dāng)線蟲在添加了酪胺的ΔtyrDC::cmR ΔadcA JUb39菌株環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)，octr-1突變線蟲也會(huì)缺乏辛醇調(diào)節(jié)。
c. JUb39菌株和其他普羅維登斯菌株會(huì)產(chǎn)生酒精異戊醇，這種酒精在濃縮時(shí)對(duì)線蟲是有害的。線蟲在食物選擇實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)優(yōu)先選擇對(duì)這類酒精產(chǎn)物的回避行為的減少的這些細(xì)菌。 d.e. 在指定菌株環(huán)境下生長(zhǎng)的野生型和突變型線蟲對(duì)測(cè)試菌株JUb39的相對(duì)偏好指數(shù)，事實(shí)上，在JUb39菌株環(huán)境下生長(zhǎng)的線蟲更喜歡JUb39菌株，而在OP50菌株環(huán)境下生長(zhǎng)的線蟲在短期食物選擇試驗(yàn)中只顯示出對(duì)JUb39菌株的輕微偏好，在octr-1和tbh-1突變的線蟲中也是如此。 f. JUb39菌株在線蟲腸道內(nèi)產(chǎn)生的酪胺（TA）通過宿主章魚胺（OA）和octr-1章魚胺受體發(fā)揮作用，以減少ASH神經(jīng)元介導(dǎo)的對(duì)JUb39菌株產(chǎn)生的回避行為，并改變攝食選擇。 結(jié)論： 研究人員認(rèn)為，綜上所述，腸道普羅維登斯細(xì)菌產(chǎn)生的神經(jīng)遞質(zhì)酪胺可以推翻宿主依賴的酪胺合成，從而調(diào)節(jié)線蟲的多條單胺能途徑，改變線蟲的行為和生理。研究人員推測(cè)，普羅維登斯菌一旦定植于秀麗隱桿線蟲腸道內(nèi)的，就會(huì)促進(jìn)更多的消耗，從而導(dǎo)致細(xì)菌穩(wěn)定的聯(lián)系和傳播。由于普羅維登斯菌是線蟲的主要食物來源，這種聯(lián)系可能是互惠互利的。 這些結(jié)果描述了一種途徑，即由天然共生細(xì)菌產(chǎn)生的神經(jīng)遞質(zhì)通過補(bǔ)充或補(bǔ)償關(guān)鍵的宿主生物合成酶的活性來指導(dǎo)宿主的感覺行為決定，從而改變宿主和微生物的適應(yīng)性。 |
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