Comprehensive analysis of ubiquitin-specific protease 1 reveals its importance in hepatocellular carcinoma

泛素特異性蛋白酶1的全面分析顯示其在肝細胞癌中的重要性

一、研究背景

HCC是最常見的原發(fā)性肝癌。目前研究人員正在關(guān)注肝癌的早期診斷，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的預(yù)防，新預(yù)后標志物和治療選擇。然而，晚期HCC患者的治療選擇仍然有限。因此，進一步了解HCC發(fā)生發(fā)展機制非常重要，尋找新的治療靶標仍然是當(dāng)前研究的重點。

泛素化是活性蛋白翻譯后修飾的一種，會導(dǎo)致腫瘤發(fā)生途徑的抑制或發(fā)展。靶向去泛素酶已被引入作為HCC的一種新型治療方法。然而，還需要更多數(shù)據(jù)來證明該策略的有效性。USP(半胱氨酸依賴性蛋白酶)，構(gòu)成了去泛素化酶的最大亞家族，在細胞穩(wěn)態(tài)和DNA損傷反應(yīng)中至關(guān)重要。USP1及其輔助因子USP1相關(guān)因子1(WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域48/WDR48)，在DNA損傷反應(yīng)過程中起調(diào)節(jié)作用。通常，USP1和WDR48形成一個復(fù)合體并發(fā)揮功能，WDR48通過穩(wěn)定其表達和介導(dǎo)其與底物的接觸來顯著增強USP1的活性。USP1是有希望的癌癥治療靶標。但是，目前對其在HCC中的作用了解有限。

二、研究思路

三、結(jié)果解析

1、USP1在肝癌中的高表達

在Oncomine數(shù)據(jù)庫中進行數(shù)據(jù)挖掘后，與正常組織相比，USP1的mRNA表達在各種類型的癌癥中均升高，例如肝癌，肉瘤和膀胱癌(圖1A)。然后，進一步關(guān)注了它在HCC中的表達。從4個數(shù)據(jù)集Roessler Liver，Roessler Liver2，Chen Liver和Wurmbach Liver中選擇了數(shù)據(jù)并對USP1表達進行了meta分析，從而進行四個研究的比較(圖1C)。

結(jié)果表明，與正常組織相比，USP1在肝癌組織中顯著上調(diào)。在Roessler Liver，Roessler Liver2，Chen Liver和Wurmbach Liver數(shù)據(jù)集中，USP1分別顯示HCC升高2.364倍，2.064倍，1.810倍和1.411倍(圖1B)。此外，使用HPA數(shù)據(jù)庫分析了USP1蛋白的表達。大多數(shù)類型的癌癥均表現(xiàn)出USP1陽性染色。圖1D顯示了正常肝臟的圖像和HCC肝臟的圖像。在正常肝中未檢測到USP1，在HCC肝中顯示弱至中度染色。

為了提高結(jié)果的可靠性，使用UALCAN數(shù)據(jù)庫進一步驗證了TCGA的LIHC數(shù)據(jù)中USP1 mRNA顯著過表達。如圖2A所示，與正常樣品相比，LIHC樣品中USP1的mRNA表達升高。亞組分析顯示，USP1在肝癌的不同亞組中也被上調(diào)，包括性別，年齡，種族和體重亞組(圖2B-E)。關(guān)于癌癥分期和腫瘤等級，USP1在1-3期和1-4級中過表達(圖2F，G)。此外，USP1在無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的HCC患者中過表達，而在有轉(zhuǎn)移的患者中則未過表達(圖2H)。USP1與TP53突變狀態(tài)呈正相關(guān)且在具有TP53突變的HCC患者中顯著過表達(圖2I)。

綜上可得，USP1的高表達與腫瘤進展密切相關(guān)。

2、USP1在HCC患者中的預(yù)后意義

由于USP1的高表達與腫瘤進展密切相關(guān)，于是推測USP1可以作為HCC患者的預(yù)后標志物。使用Kaplan-Meier繪圖儀數(shù)據(jù)庫評估了USP1在HCC患者中的預(yù)后意義。USP1高表達與HCC患者的OS，RFS，PFS和DSS有關(guān)(圖3A-D)。此外，USP1的高表達還與男性，亞洲人和非飲酒的HCC患者OS不良有關(guān)(圖3E-G)，而女性，白人和飲酒的HCC患者則與OS不良無關(guān)(圖3I-K)。對于肝炎病毒感染或非肝炎病毒感染的患者，USP1高表達預(yù)示其生存期較差(圖3H，L)?？傊?，USP1高表達與肝癌患者預(yù)后差有關(guān)。

3、HCC中USP1的突變

在cBioPortal數(shù)據(jù)庫中評估了USP1在HCC中的突變頻率。選擇了五個數(shù)據(jù)集進行了分析。USP1在肝癌中的體細胞突變頻率為0.3％，主要由錯義突變組成(圖4A)。此突變頻率相對較低，每1000個樣本中只有3個。因此，未能找到USP1突變與HCC患者的預(yù)后之間的關(guān)系。

在另一個數(shù)據(jù)庫COSMIC中進一步評估了USP1的突變類型圖4中顯示了兩個突變類型的餅圖。在大約44.44％的樣本中發(fā)生了錯義替換，在11.11％的樣本中發(fā)生了同義替換，在11.11％的樣本中發(fā)生了移碼刪除(圖4B)。取代突變主要發(fā)生在T> C(40.00％)，然后是A> C(20.00％)，A> G(20.00％)和A> T(20.00％)(圖4C)。

4、HCC中USP1表達與免疫浸潤的關(guān)系

使用TIMER數(shù)據(jù)庫研究了USP1表達與免疫浸潤的關(guān)系。使用Spearman檢驗(使用腫瘤純度進行調(diào)整)分析了USP1表達與六種免疫浸潤物(B細胞，CD8+T細胞，CD4+T細胞，巨噬細胞，嗜中性粒細胞和樹突狀細胞)豐度之間的相關(guān)系數(shù)。發(fā)現(xiàn)USP1表達與腫瘤純度有輕微正相關(guān)。此外，USP1表達與所有六個免疫浸潤物，尤其是嗜中性粒細胞和巨噬細胞有顯著正相關(guān)(圖5)。此外，分析USP1表達與相關(guān)免疫細胞基因標志物之間的相關(guān)性。與上述結(jié)果一致，USP1與幾乎所有選定的免疫細胞的基因標志物都有顯著的正相關(guān)。其中排名前五位的基因標志物是GATA3，CCR8，STAT5B，BDCA-4和STAT1。(表1)

綜上，USP1在HCC發(fā)生過程中在免疫浸潤中起關(guān)鍵作用的結(jié)論。

5、WDR48高表達與USP1相關(guān)，并預(yù)示肝癌患者預(yù)后不良

為了揭示USP1輔助因子WDR48在肝癌中的作用，評估了其表達和預(yù)后意義。使用UALCAN數(shù)據(jù)庫，WDR48在HCC中也明顯過表達(圖6A)。根據(jù)已有知識，WDR48在HCC中的表達與USP1正相關(guān)(GEPIA，圖6B)。有趣的是，發(fā)現(xiàn)高WDR48表達還與HCC患者的OS和RFS差有關(guān)(圖6C，D)。

6、與HCC中USP1和WDR48相關(guān)的差異基因

使用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫和Spearman檢驗鑒定與USP1和WDR48相關(guān)的差異表達基因(圖7A、USP1和不同表達的基因之間的相關(guān)性，D、WDR48和不同表達的基因之間的相關(guān)性)。熱圖顯示了前50個正相關(guān)和前50個負相關(guān)的基因(圖7B，C，E，F(xiàn))。根據(jù)Spearman檢驗，選擇系數(shù)> 0.4的正相關(guān)基因。

最后，選擇了與USP1正相關(guān)的1175個基因和與WDR48正相關(guān)的199個基因。其中98個基因與USP1和WDR48均呈正相關(guān)，并選擇這些基因進行進一步分析(圖8A)。將98個差異表達的基因輸入到STRING和Cytoscape中以構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖8B、98個基因與最重要的簇的相互作用網(wǎng)絡(luò)顯示為黃色)并使用使用DAVID進行GO和KEGG富集分析。分析得到以下生物過程受到顯著影響：轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，共價染色質(zhì)修飾等(圖8C)。細胞成分主要富集于核質(zhì)，核，中心體等(圖8D)。分子功能主要集中在DNA結(jié)合，染色質(zhì)結(jié)合，蛋白質(zhì)結(jié)合等方面(圖8E)。KEGG結(jié)果顯示，共表達的基因主要參與細胞周期，醛固酮合成和分泌以及雌激素信號通路(圖8F)。

7、HCC中的中樞基因的鑒定及其預(yù)后價值

首先，使用MCODE識別了PPI網(wǎng)絡(luò)中最重要的簇(圖8B，以黃色顯示)，隨后使用cytoHubba(按等級排列)確定了網(wǎng)絡(luò)的前十個中樞基因(圖9A、前十位中樞基因的相互作用網(wǎng)絡(luò))。GO分析結(jié)果表明，生物學(xué)過程(例如染色質(zhì)重塑，共價染色質(zhì)修飾和染色質(zhì)結(jié)合)受到顯著影響和富集(圖9B)。最后，在Kaplan-Meier Plotter中評估了中樞基因的預(yù)后價值。結(jié)果表明，在這10個基因中，7個基因(BPTF，SETD2，SMARCC1，UBXN7，SMC3，PBRM1和SF3B1)的高表達與不良OS顯著相關(guān)(圖9C，預(yù)后價值)，而其他三個基因則無意義(ATRX，SIN3A和USP34)。

8、驗證HCC細胞系中USP1和WDR48之間的相互作用

首先，使用蛋白質(zhì)印跡法檢測了USP1和WDR48的表達。發(fā)現(xiàn)在MHCC97H和SKHep-1中，HCC細胞系中USP1和WDR48的蛋白質(zhì)水平高表達(圖10A)。然后，使用靶向USP1的siRNA敲除了這些細胞系中的USP1。在siRNA-USP1轉(zhuǎn)染后，與NC-siRNA轉(zhuǎn)染的細胞相比，USP1在蛋白質(zhì)和mRNA水平上均顯著下調(diào)(圖10B，C，E，F(xiàn))。此外，在MHCC97H和SK-Hep-1細胞中，USP1敲除顯著降低了WDR48(圖10B，C，E，F(xiàn))。這些結(jié)果通過特定的USP1抑制劑ML-323進一步驗證。經(jīng)過50μmol/ L ML-323處理24小時后，USP1和WDR48在MHCC97H和SK-Hep-1細胞中均下調(diào)(圖10D)。此外，使用共免疫沉淀法證實了HCC細胞系中USP1和WDR48之間的相互作用，結(jié)果表明USP1與MHCC97H和SK-Hep-1細胞中的WDR48有相互作用(圖10H）。

9、SiRNA-USP1轉(zhuǎn)染或ML-323處理可降低HCC細胞的增殖

圖8F表明共表達的基因主要參與細胞周期。因此，研究了USP1在HCC細胞增殖中的作用。

首先，將siRNA-USP1轉(zhuǎn)染到MHCC97H和SK-Hep-1細胞中進行CCK-8測定以評估細胞活力和細胞增殖能力。結(jié)果表明，USP1基因敲除顯著抑制了MHCC97H和SK-Hep-1細胞的增殖(圖10G)。USP1敲除后，增殖細胞核抗原(PCNA)(USP1/WDR48,44的細胞靶標之一)顯著降低。此外，USP1敲除還降低了細胞周期蛋白D1和細胞周期蛋白E1的表達，從而通過細胞周期停滯抑制了肝細胞的生長45(圖10C，E，F(xiàn))。此外，ML-323處理還降低了PCNA，cyclin D1和cyclin E1的蛋白表達。因此，得出結(jié)論，靶向USP1可以減少HCC細胞的增殖。

四、小結(jié)

USP1在調(diào)節(jié)DNA修復(fù)中具有重要作用，因此被研究人員視為腫瘤的潛在治療靶點。文章是以問題為導(dǎo)向而開展。

• USP1在肝癌中發(fā)生了哪些改變：突變改變，表達改變或兩者兼有？

• 這些改變是否具有臨床意義，是否與患者的預(yù)后有關(guān)？

• USP1在肝癌中的潛在機制是什么？

使用信息工具系統(tǒng)地分析USP1在肝癌中的作用并證實了USP1在肝癌組織中的表達高于正常組織，且USP1的高表達顯示出臨床意義，并與HCC患者的不良生存有關(guān)。結(jié)果表明，USP1是肝癌的潛在治療靶標。機制目前仍不清楚。

• 為什么USP1的高表達與患者的不良生存相關(guān)？

發(fā)現(xiàn)USP1的高表達與免疫浸潤呈正相關(guān)，表明USP1在HCC發(fā)生過程中在免疫浸潤中起關(guān)鍵作用。此外，使用免疫共沉淀法證實了USP1-WDR48在HCC細胞中的相互作用。因此，假設(shè)USP1-WDR48復(fù)合物通過穩(wěn)定底物的活性在肝癌中起關(guān)鍵作用。為了鑒定這些重要的底物，使用GO分析，KEGG富集分析了與USP1和WDR48正相關(guān)的HCC差異表達基因的生物學(xué)功能，同時還識別了10個中樞基因，其中7個基因在HCC患者中具有預(yù)后價值。這表明，USP1-WDR48復(fù)合物通過穩(wěn)定和去泛素化這些中樞基因而在肝癌中發(fā)揮了促進腫瘤的作用。綜上，USP1的功能取決于其輔助因子WDR48，這給予了開發(fā)特定治療策略的機會。本篇文章還證明siRNA -USP1轉(zhuǎn)染或ML-323處理可降低HCC細胞的增殖。USP1敲除或ML-323處理降低了PCNA，cyclin D1和cyclin E1的表達，這意味著靶向USP1可以通過細胞周期停滯降低HCC細胞的增殖。

本篇文章也有局限性。首先，用于分析的大多數(shù)數(shù)據(jù)均來自公共數(shù)據(jù)庫，并在體外實驗中得到驗證，某些結(jié)果可能需要在未來進一步驗證。其次，除了USP1的表達改變外，還應(yīng)注意其活性的改變。但盡管如此，仍可以得出結(jié)論，USP1是治療HCC的有希望的治療靶標。

編輯：鄧慧

校審：劉安洋 林安琪