隨著生命科學(xué)的不斷進步，mRNA作為藥物被應(yīng)用到疾病治療、疫苗等領(lǐng)域。從1990年體外合成的mRNA第一次在細胞內(nèi)表達，到2020年的mRNA疫苗在對抗新冠疫苗發(fā)揮重要作用。以mRNA為基礎(chǔ)的治療方式已經(jīng)在醫(yī)藥領(lǐng)域引起了一場革命。

mRNA（Messenger RNA、信使RNA）是將DNA中的基因信息傳遞到蛋白的中間信使。mRNA疫苗治療（見下圖）是指在體外合成mRNA，將其導(dǎo)入體內(nèi)，mRNA進入細胞后翻譯表達出抗原蛋白，抗原刺激體內(nèi)免疫系統(tǒng)，激活體液免疫和細胞免疫，當(dāng)機體再次接觸同種抗原（細胞/病毒），可產(chǎn)生快速免疫應(yīng)答反應(yīng)，自我保護。

mRNA疫苗研發(fā)-生產(chǎn)-治療流程

圖片引用于 Novoprotein Scientific Inc.

mRNA疫苗具有研發(fā)速度快、靈活、生產(chǎn)工藝簡單、平臺化、容易擴充產(chǎn)能，可以用于精準(zhǔn)化和個性化治療，一次可呈遞多種抗原等優(yōu)點。mRNA疫苗屬于第三代疫苗技術(shù)（見下圖），相比于傳統(tǒng)疫苗需要通過將病原微生物及其代謝產(chǎn)物通過人工滅毒﹑減活﹑基因工程的方法制成的繁雜工序，第三代疫苗特異性更強，有效性更高，并且研發(fā)周期較快。它的結(jié)構(gòu)簡單、可人工批量合成，并且可以在研發(fā)階段進行高通量篩選，大大節(jié)省研發(fā)時間。而且相較于DNA疫苗，mRNA疫苗沒有導(dǎo)入外源基因的遺傳風(fēng)險，起效更快，效果更強。

mRNA疫苗相對于其他疫苗的優(yōu)勢  圖片引用于網(wǎng)絡(luò)

 mRNA疫苗具有工藝通用性好，研發(fā)速度快，能夠活化細胞免疫，刺激效果好，遞送效果好等特性。高的mRNA產(chǎn)量需要高效的mRNA體外合成方法，大規(guī)模生產(chǎn)選擇T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄。增強mRNA的穩(wěn)定性，降低免疫原性并提升翻譯效率，最有效的解決方案是：使用加帽酶對mRNA進行加帽，使其在細胞內(nèi)外穩(wěn)定，降低免疫原性，并且使mRNA可以被核糖體識別，啟動翻譯程序。

近岸蛋白質(zhì)提供一系列mRNA體外合成酶及試劑，解決mRNA疫苗的關(guān)鍵痛點。所有產(chǎn)品均采用藥用規(guī)格原輔料生產(chǎn)，嚴(yán)格控制宿主蛋白質(zhì)殘留、核酸殘留及常見病原體污染，符合GMP規(guī)范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量管理規(guī)程，保障生產(chǎn)過程及所有原輔料可追溯。

產(chǎn)品特點：

GMP級mRNA體外合成及修飾原料，animal-free，ampicillin-free

產(chǎn)品生產(chǎn)、質(zhì)量控制及配套文件體系，符合mRNA疫苗及藥物研發(fā)生產(chǎn)需求

經(jīng)過臨床使用驗證，單批次產(chǎn)能千萬人份，年產(chǎn)能50億人份

mRNA疫苗體外合成關(guān)鍵步驟及相關(guān)產(chǎn)品：

1、生成模板-質(zhì)粒線性化 相關(guān)產(chǎn)品：Bsa I，GMP Grade（貨號：GMP-RE026）

        此步將構(gòu)建好的質(zhì)粒酶切，處理成線性化雙鏈DNA模板，用于下一步mRNA合成。

        限制性內(nèi)切酶Bsa I 特異性識別雙鏈DNA中位點并進行酶切，可將模板質(zhì)粒酶切線性化，作為mRNA體外合成模板；

        酶切位點：

產(chǎn)品特點：

        強特異性

        受CpG、Dcm甲基化影響，剪切阻斷

        受EcoBI甲基化影響，剪切可能受影響

        不受Dam甲基化影響

2、mRNA體外合成  相關(guān)產(chǎn)品：T7 RNA Polymerase, GMP Grade (貨號：GMP-E121)

此步以DNA為模板，在體外由RNA聚合酶催化合成mRNA。

T7 RNA Polymerase（T7 RNA聚合酶）是高度特異識別T7啟動子序列的5'→3' RNA聚合酶，以含有T7啟動子序列的單鏈或雙鏈DNA為模板，以NTP為底物，合成與啟動子下游的單鏈DNA互補的RNA。T7 RNA聚合酶是體外轉(zhuǎn)錄mRNA的關(guān)鍵酶。

產(chǎn)品特點：

高度特異識別T7啟動子

20ul反應(yīng)體系，產(chǎn)量可達150ug

可對低至1ng模板進行有效轉(zhuǎn)錄

合成長度可達15k

體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA，Qsep1結(jié)果顯示，純度高，均一性好。

3、mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾：加帽加尾

   此步對mRNA進行修飾，合成功能完整的mRNA。

完整mRNA結(jié)構(gòu)

3.1、mRNA加帽(Cap0)   相關(guān)產(chǎn)品：Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade (貨號：GMP-M062)        

此步與3.2同時進行，在mRNA的5'端加上Cap0帽結(jié)構(gòu)。

在真核生物中，轉(zhuǎn)錄后的mRNA必需經(jīng)過一系列修飾才能形成完整的結(jié)構(gòu)，即在5'端形成一個帽子結(jié)構(gòu)（Cap1），3’端形成PolyA尾結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)與mRNA的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運和翻譯密切相關(guān)。

 Vaccinia Capping Enzyme（牛痘病毒加帽酶）用于給體外轉(zhuǎn)錄合成的mRNA催化加上帽子結(jié)構(gòu)（Cap0），顯著改善mRNA的穩(wěn)定性和翻譯能力，使mRNA可在細胞內(nèi)表達蛋白，避免核酸外切酶等的降解破壞。

mRNA的帽結(jié)構(gòu)是由一個7-甲基鳥苷通過一個5′–5′三磷酸酯橋連接到mRNA 鏈的5′核苷上組成。Cap-0結(jié)構(gòu)由相鄰的RNA鏈通過三種酶的依次反應(yīng)形成。進一步形成cap-1結(jié)構(gòu)需要2-O甲基轉(zhuǎn)移酶（Cat. No: GMP-M072, Novoprotein）參與，該修飾可以降低RNA在體內(nèi)引起的細胞先天免疫反應(yīng)。

產(chǎn)品特點：

高效完成mRNA加帽Cap0   

提高mRNA的穩(wěn)定性，防止被RNA酶降解                                                           

提高mRNA的翻譯效率，提高蛋白產(chǎn)量

3.2、mRNA加帽(Cap1)  相關(guān)產(chǎn)品：mRNA 2’-O-Methyltransferase, GMP Grad e (貨號：GMP-M072)

此步與3.1同時進行，在mRNA的5'端加上Cap0帽結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，再將Cap0轉(zhuǎn)化為Cap1結(jié)構(gòu)。

真核生物中，mRNA的轉(zhuǎn)錄后須經(jīng)系列修飾，在5'端形成一個特殊結(jié)構(gòu)，即帽子結(jié)構(gòu)，3’端形成PolyA尾結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)與mRNA的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運和翻譯密切相關(guān)。已知Cap1結(jié)構(gòu)存在于所有真核生物mRNA，在穩(wěn)定mRNA結(jié)構(gòu)和提高翻譯效率方面起重要作用。研究表明，體外轉(zhuǎn)錄修飾得到的Cap1結(jié)構(gòu)mRNA更不容易被免疫系統(tǒng)的RNA感受器（RIG-I）識別，因此免疫刺激更低。

mRNA Cap 2′-O-Methyltransferas （2′-O-甲基轉(zhuǎn)移酶）可利用 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體， 在 RNA 5′末端緊鄰帽結(jié)構(gòu)（Cap 0）的第一個核苷酸的 2′-O 上添加甲基基團，形成帶有 Cap 1 結(jié)構(gòu)的 mRNA。Cap1 結(jié)構(gòu)能增強 mRNA 的翻譯效率，從而可提高轉(zhuǎn)染后 mRNA 編碼的蛋白表達水平。該酶只能以帶 7-甲基鳥苷帽結(jié)構(gòu)（m7GpppN）的 RNA 為底物，不會作用于 5′末端為pN、ppN、 pppN 或 GpppN 的 RNA。帶 7-甲基鳥苷帽結(jié)構(gòu)（m7GpppN）的 RNA 可通過 Vaccinia Capping System（Cat. No: GMP-M062, Novoprotein）來制備。

產(chǎn)品特點：

使mRNA的Cap 0帽子甲基化為 Cap 1帽子

提高 RNA 的翻譯效率，提高蛋白產(chǎn)量

進一步降低免疫原性

完整mRNA在細胞內(nèi)表達GFP蛋白，加帽酶與帽類似物對比

3.3、mRNA加尾(PolyA)  相關(guān)產(chǎn)品：E. coli Poly(A) Polymerase, GMP Grade (貨號：GMP-M012)

此步在mRNA的3'端加上PolyA尾。

真核生物中，mRNA的轉(zhuǎn)錄后須經(jīng)系列修飾，在5'端形成一個特殊結(jié)構(gòu)，即帽子結(jié)構(gòu)，3’端形成PolyA尾結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)與mRNA的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運和翻譯密切相關(guān)。Poly A與成熟mRNA的穩(wěn)定性、翻譯起始以及出核運輸有關(guān)，體內(nèi)轉(zhuǎn)錄后修飾中，polyA聚合酶在RNA 3’-OH上逐一引入100-200個A堿基。

體外轉(zhuǎn)錄RNA過程中，E. coli Poly (A) Polymerase（加尾酶） 不依賴模板的存在，可以催化 ATP 以 AMP 的形式依次摻入到 RNA 的 3′末端，即在 RNA 的 3′末端加多聚 A 尾。Poly (A) 聚合酶具有很高的加尾效率，可以在 RNA 的 3′末端加入 20~200 個 A 堿基。最大程度還原體內(nèi)加尾過程。

產(chǎn)品特點：

穩(wěn)定mRNA的存在形式

引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄終止

提高RNA在真核細胞中的翻譯效率

4、其他相關(guān)產(chǎn)品

4.1、防止mRNA降解  相關(guān)產(chǎn)品：RNase inhibitor, GMP Grade (貨號：GMP-E125)

在流程2-3 mRNA合成與修飾中加入RNase Inhibitor，防止RNA降解。

RNase Inhibitor可與RNase  A形成1：1復(fù)合體，對RNase 有極強非競爭性抑制，保護mRNA轉(zhuǎn)錄后不被降解

產(chǎn)品特點：

強抑制RNase活性

穩(wěn)定性強

4.2、降解模板DNA  相關(guān)產(chǎn)品：DNase I, GMP Grade (貨號：GMP-E127)

        在流程2 RNA合成結(jié)束后，去除模板DNA。

DNase I將單鏈或雙鏈DNA隨機分解。

DNase I 去除RNA樣本種的DNA殘留

4.3、增加mRNA產(chǎn)量  相關(guān)產(chǎn)品：Pyrophosphatase, Inorganic (yeast), GMP Grade (貨號：GMP-M036)

        在流程2 RNA合成過程中加入無機焦磷酸酶，增加RNA產(chǎn)量。

        無機焦磷酸酶PPase（Pyrophosphatase, Inorganic）可催化無機焦磷酸鹽水解生成正磷酸鹽（P2O7-4 H2O PPase→2HPO4-2），一方面可去除無機焦磷酸鹽對反應(yīng)體系的抑制，另一方面為反應(yīng)提供熱力學(xué)動力，促進產(chǎn)物的生成。常用于RNA、DNA、蛋白質(zhì)的生物合成中，是一種良好的輔劑，在mRNA疫苗體外大規(guī)模合成中加入可顯著提高產(chǎn)量。

無機焦磷酸酶去除mRNA合成過程中產(chǎn)生的焦磷酸，提高mRNA產(chǎn)量