【原】StringTie 插件 | 直接在 Windows 下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組組裝與讀段計(jì)數(shù)

生信藥丸 2021-07-26

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注：同時(shí)支持 Windows 和 MacOS。

寫(xiě)在前面

前述，我已經(jīng)寫(xiě)了兩個(gè) TBtools 插件，實(shí)現(xiàn)了在純粹的WIndows環(huán)境下（非虛擬機(jī)，非WSL），使用 Hisat2 進(jìn)行基因組索引構(gòu)建以及轉(zhuǎn)錄本回帖。最近家里事情較多，期間不少時(shí)間可以天馬行空的想事情。過(guò)于具體的生物學(xué)問(wèn)題難以思考出個(gè)答案，畢竟是以實(shí)踐為主。但數(shù)據(jù)分析上的鬼點(diǎn)子倒是非常合適。
過(guò)去幾年，正是這類時(shí)間，讓我能設(shè)計(jì)出 TBtools/JIGplot，優(yōu)化出其中各式各樣的特性。正如現(xiàn)在 TBtools 的插件模式，也是臨時(shí)想到的實(shí)現(xiàn)方式。
今天躺著，突然想著：

目的是矯正基因注釋
手段是在我改造的基因?yàn)g覽器 IGV-GSAme 矯正
輸入是基因組，待矯正的基因結(jié)構(gòu)注釋以及RNA讀段回帖的BAM
操作是基于RNA的Alignments，手動(dòng)調(diào)整注釋

那么問(wèn)題來(lái)了，要在windows完成全部工作，我們會(huì)遇到幾個(gè)問(wèn)題

IGV的特性不足，通過(guò) IGV-GSAme 已經(jīng)解決
轉(zhuǎn)錄組回帖，通過(guò) TBtools 的 Hisat2 插件也解決了
基因組局部區(qū)域的有參考組裝，無(wú)解!

既然無(wú)解，那我完全可以鼓搗一個(gè)windows下的stringTie，中間做個(gè)接口，那么就可以實(shí)現(xiàn)局部組裝（注意，指定一個(gè)區(qū)域組裝，常常反而能組裝出準(zhǔn)確的結(jié)果，具體自行思考）。千里之行始于足下，在讓 IGV-GSAme 變得更強(qiáng)之前，先做一個(gè)簡(jiǎn)單的東西，TBtools插件。

StringTie Wrapper - 新的 TBtools 插件

一共兩個(gè)對(duì)應(yīng)的是 Stringtie 兩個(gè)主要功能：

Stringtie Assembly : 轉(zhuǎn)錄組組裝
Stringtie Quantify : 轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量估計(jì)

StringTie Assembly 插件的使用

對(duì)于組裝一步，參數(shù)簡(jiǎn)單，用戶只需要提供排序好的BAM文件即可，這些文件，事實(shí)上可以通過(guò)前幾天推的 Hisat-build 和 Hisat-align 插件來(lái)獲取。需要注意的有三點(diǎn)：

參考物種基因結(jié)構(gòu)注釋是可選的
設(shè)置輸出目錄而不是輸出文件，因?yàn)榻M裝時(shí)是單個(gè)bam文件單獨(dú)組裝，最后再進(jìn)行一次merge，得到最終可用的 GTF 文件（具體Fasta序列提取，可直接使用 TBtools 的 GXF Sequence Extract，請(qǐng)參考公號(hào)前述推文）
并行線程數(shù)，應(yīng)該注意，此處的并行線程數(shù)與Stringtie軟件的線程數(shù)并不等價(jià)。（我調(diào)整了stringtie源碼，編譯并使其可以在windows下運(yùn)行，但windows系統(tǒng)限制，所以只能單線程，且速度上不來(lái)。這沒(méi)關(guān)系，我們可以多個(gè)文件同時(shí)組裝，這樣也就只需要使用stringtie的單線程模式，畢竟很多時(shí)候，我們并不可能做一個(gè)樣品的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和組裝 - PS：windows下可能會(huì)慢不少，比如6G的轉(zhuǎn)錄組，估計(jì)組裝時(shí)間大概要到 1個(gè)小時(shí)，在我的筆記本上。不過(guò)同時(shí)跑2個(gè)，那么也是1個(gè)小時(shí)嘛..）
組裝結(jié)果大體如下，我做了兩個(gè)實(shí)際數(shù)據(jù)的，

StringTie Quantify 插件的使用

使用簡(jiǎn)單，用戶需要的注意的幾乎只有三點(diǎn)：

排序好的BAM文件
一個(gè)必須的基因結(jié)構(gòu)注釋文件，可以是gff3也可以是gtf，比如使用 StringTie Assembly插件整理的組裝結(jié)果。
ReadLength, 這一參數(shù)即測(cè)序讀長(zhǎng)。因?yàn)镾tringTie計(jì)算的其實(shí)是Coverage，并沒(méi)有讀段計(jì)數(shù)這一步。常見(jiàn)的操作是簡(jiǎn)單地基于Coverage反推raw counts。于是read length成為必要。

整體上會(huì)輸出六個(gè)矩陣，具體大伙自己看名字就知道是啥。

即，轉(zhuǎn)錄本水平或基因水平的Counts，F(xiàn)PKM，TPM矩陣。可查看其中某個(gè)。

注意到，我前面做StringTie Assembly的時(shí)候設(shè)置了參考注釋，所以AcoXXXX等ID為原始注釋ID（事實(shí)上是沒(méi)有被組裝出來(lái)的，一般是覆蓋率極低），而MSTRGXXXX等為已有注釋中被當(dāng)前樣品覆蓋以及新注釋出來(lái)的基因。
PS：四個(gè)插件將會(huì)一并上線至插件商店，暫時(shí)票價(jià)應(yīng)該會(huì)定位 100，打包估計(jì) 365，具體再定。

感興趣的，想上車的，請(qǐng)參考前述《Plugin | 高速版插件商店！我又有一個(gè)絕妙的 idea》推文。