生物制品生產(chǎn)原輔材料通常為生物源的（如微生物、細(xì)胞、動(dòng)物或人源的組織和體液等），具有潛在內(nèi)外源病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)。因此國(guó)內(nèi)外的相關(guān)法規(guī)要求生物制品在生產(chǎn)過程中應(yīng)包含至少一步或者多步具備滅活/清除病毒能力的工藝步驟，而且要對(duì)這些步驟的病毒滅活/清除能力進(jìn)行驗(yàn)證。理想情況下，病毒被添加到具有代表性的生產(chǎn)樣品中（該樣品與生產(chǎn)過程樣品有相同的濃度、緩沖體系和生產(chǎn)歷史等），以評(píng)估產(chǎn)品生產(chǎn)工藝清除\滅活已知和未知病毒的能力，法規(guī)要求至少達(dá)到4Lg的LRV值才是有效的清除滅活步驟。

細(xì)胞系被認(rèn)為是病毒污染的關(guān)鍵來源，細(xì)胞庫(kù)（主細(xì)胞庫(kù)[MCB]和工作細(xì)胞庫(kù)[WCB]）在用于臨床生產(chǎn)之前需進(jìn)行了廣泛而細(xì)致的檢測(cè)，以證明沒有病毒污染，ICH Q5A詳細(xì)介紹了細(xì)胞系鑒定檢測(cè)指南。

清除/滅活病毒驗(yàn)證的目的是評(píng)估生產(chǎn)工藝清除/滅活已知病毒的能力，并通過表征其清除/滅活 “模型”病毒的能力來估計(jì)。病毒清除/滅活驗(yàn)證選擇模型病毒的因素包括病毒滴度、病毒滴度檢測(cè)方法以及病毒可能對(duì)研究人員造成的健康危害。

通常用于病毒清除/滅活驗(yàn)證的小鼠或倉(cāng)鼠細(xì)胞系小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒模型是異嗜性小鼠白血病病毒（X-MuLV）和鼠細(xì)小病毒（MMV），MMV是一種小型的非包膜病毒，由于低pH條件不能使其失活，因此通常更難清除。

在新藥IND申請(qǐng)階段，需要對(duì)至少兩種模型病毒進(jìn)行病毒清除/滅活驗(yàn)證研究，通常選擇一種模式逆轉(zhuǎn)錄病毒（X-MuLV）和一種細(xì)小病毒（MMV）。在BLA申請(qǐng)階段，通常使用至少3-5種模型病毒進(jìn)行病毒清除/滅活研究。下表為一組在新藥Phase III階段鼠細(xì)胞系衍生產(chǎn)品病毒清除/滅活研究中模型病毒。

清除/滅活病毒工藝

過濾

生物制品生產(chǎn)過程中，過濾是一個(gè)關(guān)鍵的除病毒步驟，雖然過濾已被證明對(duì)較大的病毒顆粒有可靠的去除效果，但去除尺寸很小的病毒（如細(xì)小病毒）的效果較差。Miesegaes等人總結(jié)了除病毒過濾的數(shù)據(jù)、工藝操作范圍和減壓對(duì)除病毒過濾的影響。在除病毒過濾加標(biāo)研究中，病毒原液的質(zhì)量對(duì)病毒去除過濾器的性能有重大影響。高純度的病毒儲(chǔ)備溶液可確保病毒過濾器不會(huì)因來自加標(biāo)病毒的微粒而堵塞，并導(dǎo)致過濾膜蛋白質(zhì)載量顯著提升。

pH

眾所周知，低pH條件可以成功地滅活包膜病毒，這與單克隆抗體（mAb）下游純化工藝非常兼容，Protein A捕獲柱通常在低pH下洗脫，洗脫之后是低pH孵育步驟，以滅活病毒。

病毒滅活步驟通常在pH3.0和4.0之間進(jìn)行，已經(jīng)證明，穩(wěn)定的病毒滅活需要3.8或更低的pH值。在pH值為3.8或以下時(shí)，病毒滅活非常迅速，通常在10-15分鐘內(nèi)完成。對(duì)于低pH值滅活需建立滅活動(dòng)力學(xué)曲線。

有機(jī)溶劑/表面活性劑

對(duì)于一些不能耐受低pH的產(chǎn)品，通常使用有機(jī)溶劑/表面活性劑（S/D）作為滅活包膜逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法。S/D是處理血液制品的主要方法之一，也常用于滅活重組蛋白產(chǎn)品中的包膜病毒，特別是當(dāng)產(chǎn)品不能耐受低pH。常用的滅活條件是0.3% TNBP和1%吐溫-80，24℃處理至少6h；0.3%TNBP和1%Triton X-100，24℃處理至少4小時(shí)。S/D處理前應(yīng)先用1um濾器除去蛋白溶液中可能存在的顆粒（顆粒可能藏匿病毒從而影響病毒滅活效果)。加入S/D后應(yīng)確保是均一的混合物。在滅活病毒全過程中應(yīng)將溫度控制在規(guī)定的范圍內(nèi)。

色譜層析

常用的除病毒色譜層析方法有親和層析（如Protein A）和離子交換層析。

Protein A親和層析為單克隆抗體和Fc融合蛋白提供了高度的選擇性，并被廣泛用于它們的純化。Protein A親和層析通常可以達(dá)到4-5個(gè)LRV的逆轉(zhuǎn)錄病毒清除率；

陰離子交換色譜法是一種強(qiáng)大的逆轉(zhuǎn)錄病毒清除方法。在適當(dāng)?shù)臈l件下，該步驟還可以提供>4 LRV。因此，這是一個(gè)首選的病毒清除步驟，特別是對(duì)于單抗這種典型的堿性蛋白質(zhì)，可以通過陰離子層析純化及去除病毒。陽(yáng)離子交換和疏水層析已被證明具有相對(duì)較低的LRV。根據(jù)工藝條件，通?？色@得1-3個(gè)對(duì)數(shù)的LRV。

其他

A．巴氏消毒法：對(duì)于有一定熱穩(wěn)定性的產(chǎn)品，可采用巴氏消毒法，巴氏消毒法可快殺滅速偽狂犬病病毒(PRV)，Sindbis病毒和HIV-1等病毒；經(jīng)實(shí)踐證明白蛋白的巴氏消毒法對(duì)HIV和肝炎病毒是安全的，其病毒滅活條件已經(jīng)很完善。

B．干熱法：80℃加熱72h，可以滅活HBV、HCV、HIV及AV等病毒，但應(yīng)考慮制品的水分含量、制劑組成（如糖、蛋白、鹽分等）對(duì)病毒滅活效果的影響。病毒滅活用的干熱箱至少每半年驗(yàn)證一次。

在病毒清除/滅活試驗(yàn)平臺(tái)方面，恒馭生物擁有P2認(rèn)證實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)、HyPure系列高滴度高純度病毒；在清除/滅活病毒驗(yàn)證方法方面，恒馭生物可根據(jù)客戶需要對(duì)全部法規(guī)接受的主要方法進(jìn)行去病毒工藝驗(yàn)證，覆蓋生物制品（血液制品、真核細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品，如抗體、重組蛋白）、生化藥品（動(dòng)物來源）及II、III類醫(yī)療器械產(chǎn)品。

國(guó)產(chǎn)新藥研發(fā)晝夜兼程，對(duì)于藥品“質(zhì)量及安全”的研究與關(guān)注，是永恒的使命。基于此，由恒馭生物聯(lián)合佰傲谷BioValley舉辦的“GO H-Quality生物制藥安全及質(zhì)量守護(hù)者”高端閉門系列沙龍活動(dòng)之蘇州站將于2021年7月31日在蘇州金雞湖凱賓斯基大酒店舉辦。本次活動(dòng)特邀多位行業(yè)大咖齊聚一堂，通過輕松開放的氛圍，致力于打造一個(gè)深刻精致、深度交流的平臺(tái)，共同助力推動(dòng)中國(guó)生物醫(yī)藥質(zhì)量安全的發(fā)展。誠(chéng)邀您蒞臨本次盛會(huì)！

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小編聯(lián)系方式：18017839520（微信同號(hào)）

12:30-13:00 嘉賓簽到

13:00-13:05 開場(chǎng)介紹

13:05-13:40                   

主題：實(shí)現(xiàn)高效病毒清除的下游工藝開發(fā)控制策略

嘉賓：汪才坤 康日百奧 下游研發(fā)負(fù)責(zé)人  

13:40-14:20

主題：生物蛋白藥的表征

嘉賓：史力 怡道生物 董事長(zhǎng)

14:20-14:50   茶歇

14:50-15:30

主題：生物制品生產(chǎn)中病毒清除驗(yàn)證策略

嘉賓：朱向瑩 恒馭生物 CEO

15:30-16:10

主題：臨床研究質(zhì)量管理體系簡(jiǎn)介

嘉賓：蔣燕敏 和鉑醫(yī)藥 質(zhì)量部負(fù)責(zé)人

16:10-17:00  圓桌討論

﹡中國(guó)規(guī)模和創(chuàng)新速度對(duì)全球生物制藥價(jià)值鏈的影響 

﹡國(guó)外內(nèi)生物藥在 R&D、藥品質(zhì)量和人才培養(yǎng)的差距和展望 

﹡回首制藥生涯，走過的“坎”和“幸”   

主持人：朱向瑩 恒馭生物 CEO

討論嘉賓：

史   力   怡道生物 董事長(zhǎng)

秦   剛   啟德醫(yī)藥 董事長(zhǎng)（TBD）

蔣燕敏   和鉑醫(yī)藥 質(zhì)量部負(fù)責(zé)人

郭樹華   普樂康醫(yī)藥 董事長(zhǎng)

17:00-17:30

全體與會(huì)嘉賓合影

17:30

 當(dāng)日活動(dòng)結(jié)束~

1.EMEA/CHMP/BWP/398498/2005. Guideline on virus safety evaluation of biotechnological investigational medical products. In effect: 1, February 2009. www.ema.europa.eu

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