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BCA法
 蛋白質(zhì)作為生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，也是生命活動的主要承擔(dān)者，是科研工作中的重要研究對象。而在這些精細(xì)化研究工作中，測定蛋白濃度，定量實(shí)驗(yàn)，是探索蛋白生物學(xué)功能不可或缺的一個(gè)環(huán)節(jié)。依托不同的科學(xué)原理，目前已經(jīng)發(fā)展出多種不同的蛋白測定方法，其中BCA法、Bradford法和UV法在科研實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最為廣泛，不過三種方法之間各有千秋，小P今天就和大家一起盤點(diǎn)盤點(diǎn)~ 01 BCA法 原理：BCA (Bicinchoninic acid，2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉），與含二價(jià)銅離子的硫酸銅組成BCA檢測試劑（商業(yè)試劑盒中，堿性的BCA混合溶液與硫酸銅溶液分別包裝，標(biāo)記為A液和B液，二者在實(shí)驗(yàn)前比例混合，溶液呈綠色），在堿性條件下,二價(jià)銅離子可被蛋白質(zhì)還原成一價(jià)銅離子,一價(jià)銅離子能夠與BCA相互作用,兩分子BCA鰲合一個(gè)銅離子,形成穩(wěn)定的紫色復(fù)合物，在562nm處顯示強(qiáng)吸光性。在一定濃度范圍內(nèi),復(fù)合物的光密度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系，通過酶標(biāo)儀或者分光光度計(jì)以標(biāo)準(zhǔn)品蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線，隨后檢測靶標(biāo)蛋白562nm波長處的吸光值，即可換算出靶標(biāo)蛋白濃度。 特點(diǎn)：BCA法作為已知最靈敏的檢測方法之一，靈敏度高，普通BCA試劑盒檢測范圍為20-2000μg/ml，增強(qiáng)型BCA試劑盒最低檢測濃度可到0.5μg/ml，檢測范圍廣且線性穩(wěn)定；同時(shí)該方法操作較為便捷，正常情況下可在45分鐘內(nèi)完成測定；不過由于反應(yīng)中涉及“氧化”和“螯合”兩個(gè)過程，BCA法檢測結(jié)果會受到還原劑（如DTT，巰基乙醇等）、金屬離子螯合劑（如EDTA等）干擾，不易受表面活性劑（Triton X-100、SDS等）影響。 02 Bradford法 [延伸]：檢測蛋白濃度的考馬斯亮藍(lán)和染色PAGE膠的考馬斯亮藍(lán)不是同一種物質(zhì)，前者采用考馬斯亮藍(lán)G250，后者采用考馬斯亮藍(lán)R250，G250和R250分子基本骨架一樣，但是G250多了兩個(gè)甲基，與蛋白反應(yīng)迅速，染膠慢且脫色困難，故用于蛋白定量；R250與蛋白反應(yīng)較緩慢，染膠較快且易于洗脫，故用于PAGE膠染色。 03 UV法（NanoDrop） 參考文獻(xiàn)： 1. 周躍男，王湛等.淺談蛋白質(zhì)含量的定量檢測方法[J].食品研究與開發(fā)，2014. 2. 范雙雙，李正平.幾種檢測蛋白質(zhì)濃度方法的比較[N].承德民族師專學(xué)報(bào)，2004  通過以上對比我們不難發(fā)現(xiàn)，對于蛋白濃度測定，目前依舊沒有一個(gè)完美的解決方案。BCA法受還原劑、螯合劑干擾；Bradford法受表面活性劑、蛋白差異干擾；UV法受氨基酸組成干擾、核受酸影響，每一種方法都有自身的優(yōu)勢和缺陷，因此針對同一樣本采用不同的方法進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果也可能出現(xiàn)偏差。所以我們在使用時(shí)，應(yīng)當(dāng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件挑選最合適的檢測方法，這樣實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)才會更可靠!  以上就是三種常用蛋白定量方法差異盤點(diǎn)， 各位勤勞的科研園丁， 不知道你采用的是哪一種呢？ |
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