導(dǎo) 語(yǔ)

“作為一個(gè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，我們需要保證較短的DNA測(cè)序運(yùn)轉(zhuǎn)周期，正是Celero? EZ DNA-Seq文庫(kù)制備試劑盒滿足了這一需求?！蓖箍敌谴髮W(xué)麥迪遜生物技術(shù)中心（UWBC）DNA測(cè)序重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)理Molly Zeller表示。 

Molly Zeller所在的威斯康辛大學(xué)麥迪遜生物技術(shù)中心（UWBC）DNA測(cè)序重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室擁有豐富的構(gòu)建二代測(cè)序（NGS）文庫(kù)制備經(jīng)驗(yàn)。據(jù)介紹，該實(shí)驗(yàn)室可以處理各種類型和種類的樣品，包括來(lái)自世界各地的人類、老鼠、微生物、真菌等樣品，需要大量的文庫(kù)制備。該實(shí)驗(yàn)室意識(shí)到此前使用的文庫(kù)制備試劑盒費(fèi)力且昂貴，并且結(jié)果均一性不夠理想。因此研究人員開始尋找一種能夠提供快速、預(yù)算友好和統(tǒng)一工作流程的試劑盒，來(lái)解決上述問題。

此前，UWBC實(shí)驗(yàn)室使用的試劑盒采用機(jī)械打斷，步驟繁瑣，且經(jīng)常產(chǎn)生帶有接頭二聚體的文庫(kù)。這類機(jī)械打斷——使用超聲波法或聲波剪切——操作耗時(shí)，而且往往需要使用昂貴的專用設(shè)備。因此，實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)選擇試劑盒的第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是使用酶切打斷，排除了任何需要機(jī)械打斷的試劑盒。

另一方面，該實(shí)驗(yàn)室此前使用的試劑盒大多需要在每一步酶反應(yīng)后進(jìn)行磁珠純化，不僅延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)流程，而且增加了樣本損失的可能。該團(tuán)隊(duì)選擇試劑盒的第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)就是在保證文庫(kù)質(zhì)量的前提下，使用較少純化步驟的試劑盒。

此外，運(yùn)營(yíng)成本是重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保證競(jìng)爭(zhēng)力需考慮的基本因素，包括員工、耗材和試劑等成本。當(dāng)試劑盒的使用需要大量的人工投入時(shí)，人工成本在總成本中會(huì)占很大比例。該實(shí)驗(yàn)室旨在為自己和客戶的預(yù)算降低成本。因此，選擇試劑盒的第三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是有效縮短操作時(shí)間，確保每個(gè)樣品的成本更低，將節(jié)省的成本回饋客戶。

最后，選擇文庫(kù)制備試劑盒的一項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo)就是其生成的數(shù)據(jù)質(zhì)量具有較高的一致性。優(yōu)質(zhì)文庫(kù)的標(biāo)志是平滑的“鐘形曲線”（正態(tài)分布），沒有接頭二聚體的峰值。而該實(shí)驗(yàn)室此前使用的試劑盒還需要額外的接頭二聚體純化步驟，增加實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間，并可能導(dǎo)致樣品的損失。常用的接頭滴定法，只對(duì)實(shí)驗(yàn)室相對(duì)單一物種來(lái)源的樣本有效，不適用于來(lái)自不同來(lái)源的gDNA。因此，最小化終文庫(kù)的接頭二聚體也是需要考慮的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)。

基于上述選擇標(biāo)準(zhǔn)，UWBC實(shí)驗(yàn)室最終選擇了Celero EZ DNA-seq建庫(kù)試劑盒用于其基因組DNA文庫(kù)制備實(shí)驗(yàn)流程，下面Molly Zeller將為大家闡述為什么選擇該款試劑盒以及該試劑盒的建庫(kù)表現(xiàn)。

目前市面上有很多DNA文庫(kù)制備試劑盒可以選擇，UWBC依據(jù)設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)選擇了部分試劑盒進(jìn)行比較，其實(shí)驗(yàn)流程如下:

該團(tuán)隊(duì)選擇了基礎(chǔ)研究中被廣泛使用的NA12878 gDNA作為參考樣本。如表1所示，每個(gè)試劑盒都可以處理廣泛的gDNA輸入量?；诳蛻舫Ｓ玫奈膸?kù)制備輸入量，團(tuán)隊(duì)選擇了50ng用于測(cè)試比較。根據(jù)不同試劑盒對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)展開實(shí)驗(yàn)。制備好的文庫(kù)同時(shí)進(jìn)行質(zhì)控，并對(duì)通過(guò)質(zhì)控的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

注：*有增強(qiáng)劑

將文庫(kù)稀釋到2 nM后，等量混樣，在Illumina NovaSeq 6000測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。所有文庫(kù)的測(cè)序都采用了UWBC實(shí)驗(yàn)室新的測(cè)序方法，使用S2 flow cell 2x150，每個(gè)文庫(kù)的測(cè)序reads數(shù)為100M。數(shù)據(jù)處理采用bcl2fastq v2.20.0.422和FastQC v0.11.6。

每個(gè)樣本測(cè)得的reads數(shù)如表2所示，并提供了每個(gè)樣本的Q30 (每個(gè)堿基的正確率為99.9%)。其中，Celero EZ DNA-Seq，QIAseq FX和Nextera XT試劑盒全部高于90%。

插入長(zhǎng)度、重復(fù)率和堿基百分比含量都是確定測(cè)序質(zhì)量的重要指標(biāo)。插入長(zhǎng)度是指匹配到參考基因組上分析的片段長(zhǎng)度，也是片段篩選期間被保留下來(lái)的DNA片段。使用TapeStation（安捷倫）檢測(cè)的插入片段在不同試劑盒之間是一致的。

圖1.Agilent Tapestation曲線-文庫(kù)在Agilent Tapestation上跑膠以觀察片段大小。這是為了確保沒有接頭二聚體存在的情況下，計(jì)算摩爾濃度，以確定文庫(kù)的質(zhì)量。

表2.文庫(kù)測(cè)序參數(shù) (Illumina NovaSeq 6000，PE 2x150，S2 flow cell)

圖2.接頭剪切后的插入片段的分布——剪切序列中的接頭二聚體，并繪制保留片段的分布情況，以呈現(xiàn)真正的插入片段大小。 

UWBC團(tuán)隊(duì)還分析了去重后保留的序列百分比，以確定每個(gè)樣本的多樣性。保留序列的占比越高，擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的重復(fù)越少。由于每個(gè)試劑盒的樣品輸入量相同，該指標(biāo)可用于直接比較PCR的重復(fù)率。根據(jù)表2中的數(shù)據(jù)，Celero EZ DNA- seq、QIASeq FX和TruSeq DNA Nano試劑盒去重后的保留序列百分比最高。

最后，UWBC團(tuán)隊(duì)比較了所有堿基的百分比和fastq文件中GC含量占比。此前使用的文庫(kù)制備試劑盒在片段末端表現(xiàn)出很小的偏差，如圖3所示。TruSeq DNA Nano文庫(kù)制備導(dǎo)致了第八堿基出現(xiàn)偏差，表明機(jī)械打斷不會(huì)優(yōu)先剪切DNA的特定識(shí)別位點(diǎn)或堿基對(duì)。QIAseq和Celero EZ DNA-Seq文庫(kù)的序列內(nèi)容顯示，前10-12個(gè)堿基位置存在一定的偏差，這與酶切文庫(kù)制備流程的預(yù)期一致。

試劑盒對(duì)基因組的覆蓋率取決于樣本中的GC含量。因?yàn)槭褂玫牟牧鲜窍嗤?，所以該研究中的所有文?kù)都應(yīng)該有相同的GC含量分布，任何變化都表明可能污染。圖4顯示了大多數(shù)文庫(kù)制備的GC分布達(dá)到了預(yù)期。

圖4.每條read的GC含量(%)。檢查文庫(kù)的GC含量以觀察測(cè)序數(shù)據(jù)中的GC或AT含量可能存在任何潛在的偏差。結(jié)果顯示了所有序列上的堿基含量的理論分布（藍(lán)線）和實(shí)際分布（紅線）。Y軸為read數(shù)，X軸是每條read的GC%。

最終，UWBC團(tuán)隊(duì)基于選擇標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)室研究需求和上述分析數(shù)據(jù)選擇了預(yù)算友好、快速、均一性好且使用酶切片段化的文庫(kù)制備試劑盒Celero EZ DNA-Seq，并同時(shí)考慮了工作流程的方便性、UDI的可獲得性和測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量。

UWBC團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，Celero EZ DNA-Seq的實(shí)驗(yàn)流程快速且簡(jiǎn)單，有三個(gè)Pre-PCR步驟和兩個(gè)Post-PCR步驟，可以在一天內(nèi)輕松完成。該實(shí)驗(yàn)流程很容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，UWBC團(tuán)隊(duì)計(jì)劃在移液工作站中使用該試劑盒，以減少手動(dòng)操作時(shí)間。

除了比較試劑成本，還要比較人工和耗材的成本。UWBC團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，Celero EZ DNA-Seq工作流程的速度為實(shí)驗(yàn)室節(jié)省了人工成本。DimerFree接頭連接技術(shù)還使文庫(kù)準(zhǔn)備工作更進(jìn)一步，無(wú)需擔(dān)憂接頭二聚體等問題。該技術(shù)對(duì)UWBC來(lái)說(shuō)是一個(gè)巨大的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樵诖酥埃煌奈锓N、樣品類型和項(xiàng)目都需要接頭濃度滴定和優(yōu)化，以避免接頭二聚體的形成。同時(shí)，為了評(píng)估均一性，該團(tuán)隊(duì)在Illumina NovaSeq上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，需要特異性雙端index（UDIs）。Celero EZ DNA-Seq可提供384個(gè)UDI，有助于避免測(cè)序瓶頸。

測(cè)序完成后，還要關(guān)注插入片段的大小。UWBC團(tuán)隊(duì)在Illumina NovaSeq上的測(cè)序讀長(zhǎng)為2x150bp，并希望插入片段在不測(cè)接頭序列的情況下能夠重疊。與UWBC實(shí)驗(yàn)室常用的試劑盒相比，雖然標(biāo)準(zhǔn)的Celero EZ DNA-Seq實(shí)驗(yàn)流程并沒有生成相同長(zhǎng)度范圍的插入片段，但通過(guò)對(duì)酶切時(shí)間和/或片段篩選進(jìn)行一些優(yōu)化將生成期望范圍內(nèi)的片段。同時(shí)，研究對(duì)比的其他測(cè)序數(shù)據(jù)，包括多樣性、序列占比和偏差，都偏向于選擇Celero EZ DNA-Seq作為文庫(kù)制備試劑盒。雖然從該試劑盒觀察到一些測(cè)序偏差——和酶切打斷的預(yù)期一樣——但可以通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化整個(gè)樣本的片段化程度，以提供覆蓋整個(gè)基因組的信息。

此外，該團(tuán)隊(duì)還比較了Celero EZ DNA-Seq的整個(gè)外顯子組捕獲，結(jié)果顯示其適用于評(píng)估中使用的所有捕獲技術(shù)。

UWBC團(tuán)隊(duì)表示，未來(lái)將對(duì)Celero EZ DNA-Seq實(shí)驗(yàn)流程例如自動(dòng)化等，使用不同物種和不同類型的樣本進(jìn)行評(píng)估。

莫莉·澤勒（Molly Zeller）目前共同管理著威斯康星大學(xué)麥迪遜生物技術(shù)中心的DNA測(cè)序重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。她在科羅拉多州立大學(xué)(Colorado State University)獲得細(xì)胞和分子生物學(xué)碩士學(xué)位后，在那里工作了四年。Molly主要從事全基因組短讀長(zhǎng)測(cè)序、基因分型測(cè)序(GBS)、長(zhǎng)序列全基因組和擴(kuò)增子測(cè)序的基因組DNA文庫(kù)制備工作。  

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