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編譯：微科盟莫沉，編輯：微科盟木木夕、江舜堯。 微科盟原創(chuàng)微文，歡迎轉發(fā)轉載。 導讀胃腸道微生物的組成可以顯著影響全身的免疫應答，但其對傳染性疾病的發(fā)病機制和抗生素的治療效果的影響知之甚少。由于目前難以分離抗生素誘導的病原體清除和相關微生物改變的免疫效應，因此上述問題在人群中研究較少。在本研究中，研究者分別分析了兩個結核?。╰uberculosis，TB）治療的縱向研究隊列（35人和20人）和一個包含55名健康對照者的橫斷面研究數據。在這些研究中，研究者分別收集了受試者的糞便樣本（用于微生物組分析）、唾液（用于確定結核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，Mtb）的細菌負荷）和外周血（用于轉錄組分析）。此外，該研究通過比較標準TB治療和不減少Mtb載量的實驗性療法將微生物效應從病原體滅菌中分離。對來自兩個縱向隊列的微生物組-轉錄組-唾液樣本數據的隨機森林回歸分析顯示，TB炎癥狀態(tài)的重新正?；cMtb病原體清除，與Clusters IV和XIVa Clostridia的豐度增加以及Bacilli 和Proteobacteria的豐度降低有關。健康個體的獨立隊列中的外周基因表達和微生物組分析顯示出相似的關聯(lián)。該研究結果表明，抗生素誘導的病原體豐度降低和微生物變化與治療誘導的活動性TB炎癥反應變化相關，而抗生素治療的反應可能是病原體清除和微生物驅動的免疫調節(jié)的綜合作用。 原名：Gastrointestinal microbiota composition predictsperipheral inflammatory state during treatment of human tuberculosis 譯名：胃腸道微生物預測患者結核病治療期間的外周炎癥狀態(tài) 期刊：Nature Communications IF：12.121發(fā)表時間：2021.2.18
通訊作者：Michael S. Glickman & VanniBucci 通訊作者單位：康奈爾醫(yī)學院免疫與病原微生物系、馬薩諸塞大學微生物組研究中心 
圖1 本研究實驗設計概述。A.該研究調查了來自海地的三個不同隊列的微生物組與轉錄組的關系。其中，隊列1：進行2周的縱向和干預性臨床試驗，包括對研究志愿者進行的隨機臨床試驗的二次分析。在此基礎上，研究者收集了活動性結核病患者體內結核分枝桿菌的細菌載量（TTP），糞便微生物組分析和外周轉錄組學分析，然后隨機分為HRZE治療組（TB標準治療）或硝唑尼特治療組（Nitazoxanide，NTZ）。隊列2：進行6個月的縱向和觀察性研究，受試者在在6個月的TB治療過程中一直接受隨訪研究，同時收集了受試者的TTP，糞便微生物組和轉錄組數據。隊列3：（橫斷面和觀察組）由單獨招募的健康志愿者組成的橫斷面和觀察性研究，其中大約一半是健康以及結核病陰性的活動性結核病患者的家庭接觸者（family contacts，FC），另一半是沒有已知結核病暴露的社區(qū)對照（community controls，CC）。該研究也對上述個體進行了糞便微生物組分析和外周轉錄組分析。B.本研究不同研究隊列中所納入的個體數量。C.本研究所納入的受試者樣本采集及相應分析的示意圖。 1 HRZE或NTZ治療兩周后患者腸道微生物群多樣性顯著降低在海地太子港的GHESKIO中心開展了一項前瞻性、隨機、早期殺菌活性（early bactericidal activity，EBA）研究（NCT02684240），研究對象是初治、藥物易感且無并發(fā)癥的肺結核（tuberculosis，TB）成人患者。本研究中，30例受試者隨機分為兩組，一組給予NTZ治療，口服1000 mg，每天2次；另一組給予標準口服治療（HRZE），即異煙肼每天300 mg，利福平每天600 mg，吡嗪酰胺每天25 mg/kg，乙胺丁醇每天15 mg/kg，共治療14天（圖1A、2A），同時對5名受試者進行預篩選以接受HRZE治療。本試驗的主要終點是基于BACTEC液體培養(yǎng)系統(tǒng)中的痰液樣本中的細菌載量（time to culture positivity，TTP）作為微生物學評價指標。每隔一天下午6點至上午9點收集受試者的痰液樣本，以量化每種治療方案中受試者體內的結核分枝桿菌活性。與線性混合效應模型的基線TTP相比，HRZE在治療的前兩周導致受試者體內TTP可預測性增加（對應于減少的細菌載量），而NTZ作為治療的參考水平（圖2B）。盡管NTZ在體外具有較高的活性，但患者在治療14天后對TTP并沒有顯著影響（p>0.05）（圖2B）。原因可能是由于NTZ未能穿透痰液進而無法發(fā)揮抗菌作用。因此，相關受試者隨后都進行HRZE標準治療。盡管研究者在之前的研究中已經報道了使用HRZE療法可清除Clostridiales，但相關研究的橫斷面設計沒有考慮到上述影響的快速性，最重要的是，沒有包括用于評估基線微生物組成的預處理樣本。為了研究HRZE或NTZ干預引起的患者腸道微生物組的變化，該研究提取并擴增了患者腸道內細菌和古生菌的DNA，同時采用V4-V5區(qū)進行16S rDNA測序分析。分別在治療開始前和治療第14天收集患者的糞便樣本（圖1A）?；?/span>Bray-Curtis距離算法的主坐標分析（Principalcoordinate analysis，PCoA）顯示，微生物組數據中變化最大的組分定性地代表了NTZ處理兩周后患者腸道微生物組群落結構發(fā)生的變化（圖2C）。此外，為了比較兩種干預方式對患者腸道微生物組a多樣性的影響，研究者分別統(tǒng)計了每個樣本的Inverse Simpson多樣性指數，并通過線性混合效應模型（Diversity~Sex+Age+Batch+Treatment+Time+Treatment: Time+1| ID）對該指數進行了回歸分析。我們發(fā)現兩臂基線之間的α多樣性沒有差異，而兩種治療均顯著降低了微生物多樣性（p <0.01，請參閱補充數據3），NTZ治療與HRZE相比沒有顯著差異（p>0.05，參見補充數據3）（圖1D）。
圖2 經HRZE或NTZ治療兩周后均改變患者腸道微生物群多樣性，僅HRZE治療降低Mtb的細菌負荷。A.比較HRZE和NTZ體內病原菌清除效果的臨床試驗示意圖。B對于NTZ治療組和HRZE治療組，在第0天和第14天配對的結核分枝桿菌痰液樣本陽性反應時間（TTP），數據顯示為2~3個技術重復的范圍。其中, HRZE組：n=16; NTZ組: n=19。利用線性混合效應模型（TTP~1+Sex+Age+ Treatment+Time + Treatment：Time+1|ID）來確定各組治療后及預處理中差異的顯著性，其中“Treatment”表示NTZ治療組和HRZE治療組，“Time”表示患者經抗生素處理前后的時間，“：”表示相互作用項。C.基于Bray-Curtis距離算法的主坐標分析（PrincipalCoordinate analysis, PCoA）顯示HRZE和NTZ治療14天前后受試者個體間腸道微生物群落結構的差異。灰色線連接基線和第14天治療配對樣本，PCoA1清楚地區(qū)分NTZ治療后的樣本與基線或HRZE治療后的樣本。D.利用Inverse Simpson多樣性指數分析患者腸道微生物群a多樣性，其中, HRZE組：n=16；NTZ組: n=19。使用線性混合效應模型來確定差異處理對多樣性的重要性。利用線性混合效應模型（Diversity~1+Sex+Age+Treatment: Time +1|ID），“：”表示相互作用項，以HRZE作為參考水平。在基線時，兩種治療方法之間沒有顯著差異。在治療14天后，兩組均顯示出a多樣性的顯著降低。 2 在接受NTZ治療的患者中抗生素引起的腸道微生物組成改變更為明顯 為了鑒定受兩種干預方式顯著影響類群，研究者基于Limma/voom對dada2 （ASV）識別的每個測序變量的豐度進行了線性混合效應建模（ASVi（counts）~Sex+ Batch+Group+1| ID）。該模型除了能夠確定由于治療手段（預處理，HRZE，NTZ）引起的效應外，還可以量化性別和測序批次之間的依賴效應。研究者使用1| ID隨機效應來控制不同個體之間的基線差異，使用Benjamini-Hochberg FDR校正后的p值來確定受治療方式顯著影響的ASVs.上述分析表明，HRZE治療對患者胃腸道微生物的影響包括82個ASVs的耗竭，其中多數屬于Clostridiales（FDR<0.05）。值得注意的是，這些ASVs中的多數（例如Blautia spp., Butyrivibrio spp., Clostridium spp., Eubacterium spp.,Faecalibacterium spp., Gracilibacter spp., Oscillibacter spp., Roseburia spp., Ruminococcus spp., Sporobacter spp.）均參與宿主健康相關的功能，例如SCFA的產生或膽汁酸的轉化（圖3A，B）。NTZ治療對患者腸道菌群具有更實質性的干擾，共計有387種ASVs的耗竭和16種ASVs的增強。NTZ治療造成腸道中Clostridiales的顯著減少，其中包括除HRZE治療清除的一種之外的所有ASVs，還包括許多其他的Firmicutes（FDR <0.05）。此外，NTZ引起了包括K.pneumoniae, E. coli, C. freundii, S. alactolyticus以及E.faecium在內的病原菌的擴增（FDR <0.01）（圖3A，B）。通過抗生素治療可以篩選出Bacilli和Enterobacteriaceae的菌種，因為較高濃度的抗生素可以誘導產生氧化還原電位，包括腸道上皮細胞氧化還原增加。綜上所述，上述結果表明，雖然NTZ治療對患者體內的Mtb載量沒有顯著影響，但其對患者腸道微生態(tài)的擾動比HRZE治療更為明顯，包括大量Clostridia的耗竭，以及篩選一類與已知疾病相關的耐氧病原菌。
圖3 NTZ和HRZE治療引發(fā)受試者腸道微生物組的變化。A.火山圖顯示了基于ASV水平在HRZE和NTZ治療后（第14天）和預處理（基線）之間的差異。每個ASV的顏色按菌種的系統(tǒng)發(fā)育順序排列。對每個ASV的單一線性混合效應模型（ASVi（counts）~Sex+Batch+Group+1|ID）進行擬合，以確定由于處理因素而產生的差異，同時考慮測序批次和性別。B.受HRZE或NTZ干預顯著影響的404個ASV的豐度的組內無監(jiān)督分級聚類分析（FDR < 0.05）。右側的注釋（HRZE和NTZ）表示是否每個ASV都受到治療的顯著干擾。y軸上的P值根據Benjamini-Hochberg 算法計算FDR進行調整。由于以上結果突顯了兩種療法對結核病的治療和胃腸道微生物組成的不同影響，研究者認識到這提供了一個獨特的機會來推測腸道微生物組成、結核分枝桿菌的細菌載量和外周基因表達之間可能存在的關聯(lián)。由于受試者在被分配到上述兩種治療方案之前具有一定的隨機性，因此研究者使用Limma/Voom的線性混合效應模型來對每個宿主轉錄本的豐度進行建模（Genei （Counts）~Sex+Batch+Group+1|ID）分析。該研究通過對基線與NTZ或HRZE治療后對比的limma/voom表達數據進行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），確定了治療引起的整體轉錄本豐度變化的功能模式。該研究使用GSEA評估了MiSigDB Hallmark途徑的富集程度，目的是對可能表達的生物學途徑進行廣泛的概述。在接受HRZE治療的受試者中，研究者在第14天觀察到炎癥反應顯著減少（FDR <0.05），包括IFNa應答，IFNg應答，以及NFκB介導的TNFa通路和IL6 JAK STAT3通路，上述應答與抗生素引起細菌病原體水平降低的系統(tǒng)性免疫學作用有關（圖4A）。相比之下，NTZ的治療則顯示了相反的效果。HRZE治療下調了炎癥相關的信號通路，包括TNFa信號通路、IFNg信號通路和I型干擾素信號通路，而在第14天NTZ處理后均顯著富集（圖4A）。NTZ治療也上調了其他幾種途徑，例如低氧，細胞凋亡和活性氧（reactive oxygen species，ROS）等被認為是免疫失調的標志物。由于該研究發(fā)現NTZ治療可改變患者腸道微生物組的組成結構，同時使痰液（TTP）中的Mtb細菌負荷基本保持不變，因此研究者推測NTZ引起的上述效應可能由于微生物組成改變的部分功能。為了進一步了解這兩種藥物對基因特征的影響，研究者首先集中分析了一組已發(fā)表的活動性結核病的轉錄標志物，這些標志物來自多個人群隊列，并且跨越測序平臺（微陣列和RNAseq）。經過分析發(fā)現，上述標記物在LTBI、活動性結核病和健康對照組個體之間差異顯著。在該研究中，研究者在預處理的活動性結核病受試者中檢測到373個轉錄本中的363個。在HRZE或NTZ治療兩周后，研究者定義了這些轉錄本的三類主要變化：（1）重新正?；?/span>HRZE/NTZ治療前后變化的轉錄本，與之前文獻報道的活性TB和對照組/LTBI之間的差異倍數具有相同的趨勢）；（2）不變（在HRZE / NTZ治療前后的轉錄本表達無變化）；（3）惡化（HRZE/NTZ治療前后的差異基因倍數變化與文獻報道的活性TB和對照組/LTBI之間的倍數變化關系相反。其中，有157個活性TB基因受HRZE治療的顯著影響（FDR< 0.05）（圖4B）。在這157個受影響的基因中，有144個（92％）隨著治療進程而逐漸恢復正常（即，活動性TB與對照組相比，顯示出相同的倍數變化趨勢），而有13個（8％）則惡化了（也就是倍數變化的相反方向）。另一方面，研究還發(fā)現這些結核病相關的炎癥基因中只有4個受到NTZ治療的影響，且均屬于急性發(fā)作期（圖4C）。由于NTZ治療在不影響Mtb疾病緩解率的情況下改變患者的腸道微生物組成，因此研究者推測可能存在其他宿主相關的轉錄本亞群與腸道微生物的依賴性免疫相關，可能對上述微生物結構的改變有響應。為了驗證上述假設，同時考慮到微生物失調和自身炎癥條件，例如炎癥性腸病之間已經建立的聯(lián)系，該研究選擇了最近發(fā)表的一組包括880個基因，與無癥狀對照相比，上述基因在IBD患者的結腸活檢組織中表達顯著差異。在這880個基因中，有364個在本研究的數據中被檢測到。研究者將重新正常化定義為由于與對照/活性IBD經抗菌處理而具有相同倍數變化的基因。盡管與NTZ治療相比，HRZE干預對患者腸道微生物組的影響更有限，但該研究仍然發(fā)現HRZE治療導致了117個基因的改變（FDR <0.05）（圖4D），其中NTZ治療與其中55個基因的變化有關（FDR <0.05）（圖4E）。上述結果表明，HRZE和NTZ治療可能會引起患者產生微生物相關的外周炎癥變化。
圖4 HRZE和NTZ處理組的Hallmark通路基因集富集分析和基因表達比較。Hallmark基因通路改變與HRZE（A）或NTZ（B）治療2周相關。與基線相比，陽性是指在治療2周時通路過表達（up），陰性是指在治療2周時通路表達下調（down），箭頭大小表示顯著性水平。結核病治療相關的外周血液轉錄本強調了治療后HRZE（B）或NTZ（C）基因表達與基線相比的差異變化。HRZE治療使144個有效的TB炎癥相關轉錄本的表達重新正常化，即接近健康狀態(tài)，僅使13個炎癥轉錄本的表達上調。而NTZ治療使4個炎癥轉錄本上調。每種處理影響與TB相關的外周血轉錄水平的顯著性定義為在limma/voom模型中，對于變量Group而言，其FDR的p值小于0.05。HRZE治療（D）和NTZ（E）導致不同基因的重新正?；℉RZE 66，NTZ 34）或加?。℉RZE 55，NTZ 21）。與IBD相關的外周血轉錄本受不同治療方式影響的顯著性定義為在limma/voom模型中，對于變量Group而言，其FDR的p值小于0.05。y軸上的P值根據Benjamini-Hochberg 算法計算FDR進行調整。4 HRZE治療隊列中患者腸道微生物和外周炎癥的縱向觀察分析為了驗證HRZE治療兩周后的觀察結果并確定隨著治療時間的延長可能發(fā)生的影響，該研究招募了一個縱向治療隊列（20人）以評估HRZE治療6個月期間對疾病的緩解情況，并進行定期采樣患者唾液樣本用于TTP檢測，糞便樣本用于微生物組分析，外周血樣本用于轉錄組測序（圖5A）。所有參與者均接受HRZE標準治療（異煙肼每天300 mg，利福平每天600 mg，吡嗪酰胺25 mg/ kg每天和乙胺丁醇15 mg/kg每天）。在治療的基線，第7天，第14天，1個月，2個月和6個月檢測唾液樣本中結核分枝桿菌的細菌負荷（TTP），同時，在每個時間點也收集患者的糞便樣本用于微生物組測序分析，在基線，第14天和2個月收集患者的全血進行轉錄組學分析。上述結果與在HRZE/ NTZ中的HRZE干預組的觀察結果相似，治療兩周后，TTP顯著高于基線（p <0.05）。同時，干預兩個月后的TTP也比兩周時顯著增加，該結果表明抗生素處理對結核分枝桿菌殺菌效果（p < 0.05）（圖5B）。對患者微生物組結構變化的縱向分析顯示，患者的腸道微生物的多樣性在治療7天后顯著下降，而在治療1個月后增加，但在隨訪6個月時仍明顯低于基線水平（p < 0.05）（圖5C）。使用與上述相同的方法進行了Limma/Voom差異分析，以確定治療方式和時間對患者腸道微生物組和外周轉錄組的影響。如研究者之前的研究結果一致的是，在治療一周后發(fā)現HRZE治療可以顯著降低腸道中Clostridiales的豐度，與基線相比，上述Clostridiales ASVs中的大多數甚至在6個月的隨訪時間點時仍然顯著降低，（圖5D）。總體而言，與基線相比，在第7天，有19個ASVs出現耗竭，而3個ASVs增加；第14天，有61個ASVs出現耗竭，2個ASVs增加；而一個月時，與基線相比，有83個ASVs出現耗竭且無新增。因此，在治療的第一個月，相對于基線樣本，受試者腸道微生物組多樣性顯著降低。然而，在治療過程的后期，該研究發(fā)現了不同的趨勢。相對于基線，與HRZE治療兩個月的第0天相比，該研究發(fā)現有11個ASVs的豐度減少，而有53個ASVs的豐度增加。在HRZE治療第6個月時，與第0天相比，該研究發(fā)現有3個ASVs顯著降低，而有327個ASVs增加（圖5D）。在2個月和6個月時，特異性ASVs的升高在不同患者個體之間具有相對的異質性。此外，一些在第0天未檢測到Clostridiales ASVs的受試者在隨后的兩個時間點出現富集?？傮w而言，該縱向分析表明，在HRZE治療一個月后，多數可能受到該治療影響的ASVs都將出現耗竭，但在治療2個月到6個月之后也會逐漸恢復。此外，該結果還表明可能會有在第0天未被檢測到的與系統(tǒng)發(fā)育相關的ASVs取代某些菌群。與基線相比，在治療的兩周（第14天）和兩個月時，該研究發(fā)現受試者外周炎癥的明顯變化。在HRZE/NTZ試驗隊列中發(fā)現常見炎癥通路的下調（圖5E）。有趣的是，將第56天與基線或第14天的數據進行比較，該研究發(fā)現炎癥基因進一步減少，這可能是由于第56天TTP進一步增加所致（圖5F-K）。利用多組學約束的數學建?？梢詤^(qū)分胃腸道微生物和結核分枝桿菌對外周炎癥特征的貢獻程度。接下來，研究者嘗試確定胃腸道微生物和Mtb的動態(tài)變化在預測外周炎癥基因趨勢變化中的相對貢獻。作為結核病炎癥狀態(tài)的一個基本反映，該研究推斷這種狀態(tài)的緩解可能受到病原體清除和微生物組改變的上游因素的共同影響。研究者假設可以通過利用通過利用HRZE治療的個體可變性，以及利用HRZE/ NTZ試驗隊列中NTZ組的數據，可以實現對這些關系的建模。這是因為NTZ組實際上可以作為有效的實驗對照，可以在沒有Mtb改變的情況下檢測胃腸道微生物群和基因表達變化。具體來說，該研究的目標是確定在三組抗生素治療的患者中，菌群豐度變化與炎癥通路顯著變化相關的特定微生物群。為了訓練上述模型，研究者使用了HRZE / NTZ試驗隊列和縱向觀察隊列中的所有結果，共34個配對樣本（圖1）。同時使用來自兩個縱向隊列（HRZE /NTZ試驗和HRZE縱向觀察隊列）的所有數據為每個炎癥途徑進行擬合來挖掘在多個數據集中通用的模式，每個模型都對80 %~20 %的數據進行訓練驗證分區(qū)，這種方法適合于臨床研究中常見類型的多組學數據集。重要的是，與傳統(tǒng)的多元線性回歸分析相比，RFR建模具有明顯優(yōu)勢，因其與模型結構（例如，非參數回歸）無關，不需要滿足經典回歸分析所需的通用假設，并且能夠執(zhí)行設定的排名特征選擇。重要的是，盡管與傳統(tǒng)回歸分析相比，RFR的解釋不那么直接（例如，本身沒有回歸系數），但其下游分析，包括排列重要性（Permutated importance）和累積局部效應（Accumulated local effects，ALE）可以用于評估預測因子（例如TTP，微生物組組成等）的重要性及其對因變量的影響（例如宿主外周炎癥標記）。
圖5 HRZE治療引起患者腸道微生物的組成和外周炎癥相關基因表達的縱向變化。A.研究隊列示意圖。B.在基線（19個生物獨立樣本）、第14天（14個生物獨立樣本）、1個月（5個生物獨立樣本）和2個月（9個生物獨立樣本）測量至陽性的時間。為了確定不同時間點的TTP差異的統(tǒng)計學意義，該研究擬合了線性混合效應模型（TTP ~ Sex+Age +Time+ 1|ID）。研究者檢查了與時間變量相關的p值，以確定TTP的顯著差異（p值<0.05）。C.計算每個受試者在基線（20個生物獨立樣本）、第7天（7個生物獨立樣本）、第14天（19個生物獨立樣本）、1個月（13個生物獨立樣本）、2個月（13個生物獨立樣本）和6個月（13個生物獨立樣本）的微生物群落多樣性，使用Inverse Simpson指數計算微生物組的a多樣性。D. 火山圖顯示在第7天、第14天、第30天、第56天和第180天微生物群落組成與倍數變化之間的差異性。E. 第14天與基線，第56天與第14天以及第56天與基線之間的Hallmark Pathway計算的歸一化富集得分。F-H火山圖顯示治療后第14天與基線、第56天與第14天以及第56天與基線的TB轉錄水平差異。I-K火山圖顯示Palmer等人的研究中在治療后第14天與基線，第56天與第14天以及第56天與基線之間檢測到的IBD病例與對照組的轉錄水平差異。當繪制具有顯著排名重要性值（p < 0.05）的預測變量的ALE曲線的平均斜率時，該研究發(fā)現TTP的增加（痰液中Mtb的減少）和Clostridia ASVs豐度的增加，特別是Clostridia IV和XVIa，其已被證明可通過SCFA的產生來誘導抗炎反應E rectale, F.prausnitzii, G. formicilis, E hallii, O ruminantium, D. formicerans, S.variable, B. faecis,和 B. obeum。上述菌群的豐度與外周促炎反應的減少相關，包括INFγ，INFa，炎癥反應以及IL6 JAK STAT3的信號傳導（圖6）。相反，E. coli和 E. faecium豐度的增加與炎癥加重有關（圖6），表明這些物種在胃腸道內的過度生長是微生物失調和炎癥的標志，通常也與不良的臨床結果相關。綜上所述，該研究的數據和相關的計算分析表明，伴隨結核病治療的炎癥基因表達的變化與導致病原體清除的藥物的抗菌活性以及抗生素誘導的微生物組成變化有關?；诖私＝Y果，研究者提出了微生物相關炎癥作用的兩個模式。首先是由于Clostridia（尤其是Clostridia IV和XVIa）的耗竭加劇了TB相關的炎癥反應，這在HRZE和NTZ治療組中均具有顯著差異。另外，僅與NTZ治療相關的病原體如E.faecium, S. alactolyticus和E. coli,的升高也可能加劇個體中的炎性相關途徑表達上調。重要的是，由于該研究的模型明確說明了所有受治療方式影響的ASVs的豐富（即，通過將模型中的微生物種類作為預測因子來控制所有細菌的存在和豐度）。因此，上述病原菌的豐度與宿主炎癥相關反應的加劇相關表明，已確定的微生物組變化與宿主免疫應答的關聯(lián)可能不僅僅反映Clostridia的動態(tài)變化。基于此模型，還研究假設結核病的緩解可能與梭狀芽胞桿菌的保存有關，而它們的耗竭和與病菌病相關的腸桿菌科細菌或芽孢桿菌的增強可能會減慢消融甚至支持炎癥加重。基于該模型，研究者假設結核病的緩解可能與Clostridia（尤其是Clostridia IV和XVIa）的豐度升高有關，而其在腸道內的耗竭和隨后與菌群失調相關的Enterobacteriaceae和 Bacilli pathobionts的升高可能阻止疾病緩解甚至加劇炎癥的惡化。
圖6使用隨機森林回歸分析宿主免疫相關的外周血液基因特征與腸道微生物組成和TTP變化之間的關系。熱圖表示ALE曲線的變化趨勢。藍色/橙色表示與特定炎癥通路變化顯著相關的特征，藍色表示負相關，橙色表示正相關。對于每條免疫途徑，從置換重要性分析中調整的Benjamini–Hochberg FDR的p值小于0.05，則認為該路徑-ASV之間顯著關聯(lián)。黑色圓點用于識別每個特定宿主路徑的建模識別的最重要預測因子（即，如果缺失將導致模型預測和結果之間的均方誤差最大增加的預測因子）。該分析表明，TB相關負荷的減少和與宿主健康相關的ClostridiaIV和XIVa豐度的增加可以用來預測宿主炎癥反應的減弱。相反，患者腸道中耐氧菌（包括Enterococcus, Streptococcus和E.coli）的豐度增加則預示著宿主炎癥反應的加劇。5 驗證隊列中健康對照腸道微生物組與外周基因表達的關系研究者對兩個縱向治療隊列的數據進行機器學習建模表明，特定的腸道微生物類群與宿主外周血中免疫相關的基因特征有關。具體地說，Clostridia的高豐度與炎癥（如干擾素a、干擾素g、IL6/JAK/STAT3、炎癥反應基因信號）呈負相關，而常見耐氧病原菌的高豐度與上述炎癥的惡化有關。為了評估上述發(fā)現的普遍性，研究者推測即使在健康個體中，上述細菌定殖的不同水平也與宿主免疫相關的外周血基因的不同水平相關。為了驗證這一假設并最終從模型中驗證，研究者分析了來自兩個健康對照隊列的一組人群數據。這些數據的一個子集已在該研究團隊已發(fā)表的工作中報導，即來自海地同一社區(qū)的結核病陰性健康家庭接觸者（Family Contacts，FC）和健康未接觸者（Community Controls，CC）的橫斷面研究。對于這兩個隊列，該研究總共包括55名健康對照，其中有9名FC和36名CC，研究者收集了微生物組16S rRNA測序數據和外周血轉錄組數據。研究者首先試圖驗證上述結果，即在其FC和CC的驗證對照隊列中，受試者外周血液轉錄模式在HRZE治療后恢復正常，在NTZ治療后惡化（這是通過我們與已發(fā)表的對照/活動性結核病基因簽名數據集的比較確定的）仍然有效（隊列3）。為了將轉錄本豐度與免疫途徑的富集聯(lián)系起來，研究者利用R語言的GSVA軟件包進行了單樣本基因集富集分析。研究者首先對本研究中所有樣本的通路樣本NES得分進行了無監(jiān)督聚類分析，發(fā)現來自不同隊列的個體在不同的生物路徑上有廣泛的差異（圖7A）。然后，研究者針對HRZE / NTZ試驗和長期觀察隊列分別使用線性混合效應模型，將每對FC/CC與治療前或治療期間樣本之間的歐氏距離（Euclidean distance）與時間、治療和患者ID進行回歸分析。結果發(fā)現，在HRZE/NTZ試驗和長期觀察隊列中，與治療前（第0天）相比，HRZE治療顯著縮短了到FC/CC樣本之間的距離（HRZE/NTZ試驗中HRZE的p值<1e?20，縱向的觀察性HRZE治療隊列<1e?10，縱向觀察性HRZE治療隊列的p值<0.05）。相反，在HRZE/NTZ試驗中，與治療前p值相比，NTZ干預增加了到FC/CC的距離，該結果再次驗證了NTZ誘導的患者體內炎癥反應的加劇。該研究對每條通路的微生物組數據進行了RFR建模分析，并將結果總結在圖7B中。令人驚訝的是，研究者發(fā)現大量Firmicutes尤其是Clostridia與許多特征的標志性分子通路相關。更有趣的是，該研究發(fā)現與宿主健康相關的Clostridia，包括F. prausnitzii, Rumonoccocus spp.和C.catus的ASVs豐度較高，與包括INFa和INFg在內的促炎途徑的減少有關。這種在穩(wěn)態(tài)條件下的獨立分析與該研究在HRZE/NTZ隊列試驗和HRZE治療隊列的縱向觀察性建模分析的結果一致（圖6）。上述結果是在來自海地社區(qū)的55名志愿者的隊列中進行的，從而更加說明了特定的胃腸道微生物群的相對豐度與宿主炎癥反應相關的外周基因表達有關，而這些特定的微生物類群在結核病的治療中受到顯著影響。
圖7對獨立的健康對照人群的微生物組和血液外周基因表達的分析證實了特定腸道微生物和宿主外周基因表達之間的關聯(lián)。A.對于本研究中的所有隊列，基于每個樣本的MiSigDB的50個Hallmark途徑的NES得分。使用DSEeq的方差穩(wěn)定化變換計數計算NES得分，用R中的GSVA軟件包計算，并在所有樣本中按比例縮放后繪制（Z得分）。B.將特定微生物類群與Hallmark途徑相關聯(lián)的隨機森林回歸分析。圖中僅顯示在RFR模型中標識的路徑。通過取每個關系的ALE圖的一階導數計算出的“Relation”，如果該路徑與特定的ASV正相關，則該“Relation”為正；如果該路徑與特定的ASV負相關，則該“Relation”為負。自從微生物組高通量測序技術問世以來，研究人員已經清楚地認識到，抗生素的使用是清楚體內微生物最有效的手段之一，其作用具有急性和持久性的特點。特定的微生物可以對宿主的免疫效應產生特定影響，包括影響免疫細胞亞群的豐度和功能。大量基于小鼠的研究數據已經證明了抗生素對體內微生物組成和功能的影響，以及這些微生物對宿主免疫細胞的后續(xù)影響。然而，抗生素誘導的微生物群擾動在什么程度上可以顯著改變機體抗感染治療的結果，或者在人體腸道微生物群中的組成變化和外周基因表達之間存在什么關系仍是未知的。通常認為，抗生素清除感染的作用是通過直接殺死病原體和通過微生物群調節(jié)免疫應答，而抗生素對病原體的殺滅作用也可能部分被微生物群擾動所引起的有害免疫應答所抵消。上述動態(tài)過程尤其可能與肺結核等慢性感染的治療有關，在這種疾病狀態(tài)下，抗生素治療的時間延長，并且疾病的進展反映了體內病原體的負荷和導致組織破壞的慢性癥狀相關炎癥介質的結果。對抗生素敏感的結核病患者通常需要使用六個月的抗生素，其中主要是基于分枝桿菌的特異性藥物治療。在這項研究中，研究者報告了HRZE治療對活動性結核病患者的早期和晚期腸道微生物組的影響，并證明了在僅進行了兩次治療后，在結核病治療患者的橫斷面研究中觀察到的相同變化趨勢（比較治愈者和LTBI個體）。經過數周的治療，研究發(fā)現HRZE的治療條件下，對患者腸道中Clostridia的豐度有顯著影響，同時這一發(fā)現在小鼠實驗中也得到證實。鑒于治療結核病藥物靶向分枝桿菌的特異性以及小分子物質相互作用影響微生物的組合特性，因此很難預測HRZE療法主要針對厚壁菌門中的Clostridia，而Mtb所屬的放線菌門不受影響。小鼠實驗結果表明，這種抗梭菌的作用主要由利福平/ PZA的治療所驅動。Clostridia是腸道微生物群中的免疫活性成分，可以產生多種代謝產物，例如短鏈脂肪酸和其他化合物。 基于NTZ / HRZE的研究使本研究能夠剖析病原體清除和微生物組擾動對疾病治療的相對貢獻度。因為標準療法既減少了Mtb細菌符合又擾亂了體內的微生物組，而NTZ對Mtb的平均負荷沒有顯著影響，但是確實以與HRZE重疊的方式干擾了體內的微生物組成。同時，在縱向隊列中擴展了上述發(fā)現，該隊列追蹤了患有活動性結核病的患者在治療后一周，兩周，一個月，兩個月和六個月的變化情況，證實了抗生素使用對體內微生物組的擾動會對宿主外周基因表達產生系統(tǒng)性影響。進一步，該研究推測患者對結核病治療響應的巨大差異可能是由于抗生素對微生物群影響異質性的部分作用。為了驗證所推斷的微生物群-宿主炎癥之間的潛在關系，研究者從一個獨立的海地健康人群隊列中進行了微生物組和血液轉錄組的分析。值得注意的是，盡管與活動性結核患者相比，炎癥途徑的外周水平降低，但研究再次發(fā)現，ClostridiumIV和XIVA的豐度升高與促炎途徑中的表達減少有關。上述結果支持了本研究的結論，即無論是在結核病的疾病狀態(tài)下還是在穩(wěn)態(tài)條件下，微生物組的組成決定了全身炎癥狀態(tài)。進一步，考慮到用配對樣本解釋微生物組地組成與周圍基因表達之間的關系所面臨的挑戰(zhàn)，將樣本隨機分配到對機體系統(tǒng)性影響差異顯著的藥物組合中，并嘗試用適當的算法進行此類分析。對于單組學微生物組和RNA seq數據，該研究選擇使用limma / voom來模擬這些數據中的變化，因其具有對多種效應進行建模的能力，同時可以將受試者的基線值用作隨機效應。對于多組學整合數據，該研究使用了隨機森林回歸。上述分析結果以兩種方式突出了這些模型的實用性：（1）通過提供支持或反對關于許多潛在相關參數之間具有臨床意義的關系的特定假設的證據，以及（2）通過提供這些模型的多組成分（即特征）之間的假設生成關系，這些關系可以在小鼠、驗證隊列或其他模型系統(tǒng)中進一步測試。 該研究的主要目標之一是通過使用快速且無創(chuàng)的測量方法（例如，糞便DNA測序，唾液細菌負荷和血液樣本轉錄組測序）來推斷人體腸道微生物群、病原體負荷和宿主炎癥狀態(tài)之間的聯(lián)系。潛在的理論基礎是，對這些關聯(lián)的分析可以引導在體內和體外的后續(xù)機制性研究工作，不僅旨在驗證，而且還可以建立起靶向微生物組的干預策略，從而提高結核病治療期間的炎癥緩解。而上述分析是基于TTP是足以預測結核病對全身免疫反應的影響的預測變量所進行的。此外，還要考慮腸道微生物組的改變不僅可能影響全身性炎癥反應，而且還可能影響肺部滯留的免疫細胞的類型和數量。此外，本研究中得出的任何關聯(lián)結果都可能無法充分解釋機體腸道微生物-炎癥反應-病原體關系的潛在變量或混雜因素。同時，盡管上述分析是在獨立的隊列中進行的，但研究驗證已識別的微生物外周基因表達的相關性分析也適用于健康對照隊列，而對沒有結核病但患有其他疾病的人進行驗證可能會比健康人群更容易產生假陽性結果。因此，未來的研究工作將著眼于確定在新的獨立結核病治療隊列中是否存在上述已確定的關聯(lián)。 該數據表明，在結核病患者進行治療的前14天內，患者體內炎癥反應的消退（通過外周血轉錄組學分析）可能既受到體內Mtb負荷減少的影響，也受到抗菌素誘導的腸道微生物群擾動的影響，而后者可能直接作用于全身性的免疫功能改變。與這兩個因素密切相關的途徑中，一種是活動性結核病的特征性激活途徑：干擾素γ、I型干擾素和腫瘤壞死因子α。越來越多的證據表明，活動性結核病的結果反映了體內病原體的負荷和包括IL-1和IFNγ在內的細胞因子的混合作用，而后者則加劇了疾病的進展。該研究表明，伴隨結核病治療的腸道微生物組的擾動是早期治療期間這些相同途徑正常化的預測標志物之一，表明腸道微生物組的改變可以影響或預測結核病緩解的速度。在患者治療的前兩周，病原體殺滅是主導因素，但在治療的后期，當病原體殺滅減緩時，治療過程中炎癥反應相關微生物組成依賴的調節(jié)作用可能會發(fā)揮重要作用。在健康對照隊列中，腸道微生物的組成和外周基因表達之間的關系驗證，特別是上述相同的促炎和抗炎途徑的共同表達，表明這些關聯(lián)可以延伸到其他人群。而上述關聯(lián)是屬于因果關系，還是作為另一種狀態(tài)的生物標志物，將是本研究未來的前沿方向。接下來的研究工作將致力于將本研究提出的分析工具和研究設計思路應用于結核病治療的后期，以檢查治療過程中的腸道微生物群的改變是否與臨床相關的治療結果相關，以及Clostridia的豐度是否與體內Mtb的清除速度或伴隨活動結核病的炎癥反應的消退相關。這些研究為靶向腸道微生物作為結核病治療預測指標的相關研究提供參考，同時有助于進一步分析治療結果的個體間異質性。 結核?。?/span>tuberculosis，TB）是由結核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，Mtb）感染引起的一種傳染病。腸道菌群與結核病之間存在相互作用關系，主要通過宿主免疫系統(tǒng)產生。在Mtb感染后，機體可產生一系列復雜的免疫反應，這個過程涉及多種免疫細胞及細胞因子（如CD4+T細胞、巨噬細胞、TNF-a、IFN-g等），尤其是CD4+ T細胞，其分化的Th1/Th2細胞亞群可調節(jié)抗結核免疫反應的方向。鑒于結核病標準治療可以引起胃腸道微生物群的顯著變化,包括許多梭狀芽胞桿菌物種的耗竭,上述改變可能與機體系統(tǒng)性炎癥反應有關。然而，由于HRZE療法在治療早期可以迅速消除結核分枝桿菌。因此，如果沒有一個具有Mtb病原體殺滅或微生物群擾動，同時又不是兩者兼具的對照組，則很難將消滅Mtb的免疫效應與腸道微生物群的干擾分離開來。因此，該研究分別結合了三個獨立的臨床隊列，分別通過對糞便樣本進行16SrDNA測序、外周血轉錄組分析和唾液樣本中結核分枝桿菌豐度進行了分析。該研究通過比較結核病標準療法和不減少結核菌載量的實驗性療法，可以獨立研究腸道菌群對結核病治療的影響，并指出特定菌群組成與結核病恢復期炎癥指標下降有關。上述研究為探討腸道共生菌群對感染性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程的影響提供了新的研究思路。
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