編譯：卓求，編輯：小菌菌、江舜堯。

原創(chuàng)微文，歡迎轉(zhuǎn)發(fā)轉(zhuǎn)載。

共招募85例AS患者和62例15～65歲HCs，所有患者在首次就診時(shí)均未接受治療。目前患有胃腸道疾病、慢性或急性感染或嚴(yán)重潛在疾?。ㄈ缂毙怨跔顒?dòng)脈綜合征、慢性腎功能衰竭和腫瘤）的受試者也被排除在外。并從這些AS患者中收集23份治療后糞便樣本進(jìn)行比較。糞便樣本采集后放置在-80℃下，2小時(shí)內(nèi)快速冷凍并用干冰寄送，在Illumina平臺(tái)上對(duì)樣本進(jìn)行雙端測序，并最終實(shí)現(xiàn)物種和功能注釋。

1.紊亂的AS腸道微生物組成與功能

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控后，平均每個(gè)樣本獲得7300萬有效序列，然后將每個(gè)樣本的有效序列和9.9 M人類參考基因組進(jìn)行比對(duì)得到基因文件。健康對(duì)照組和AS組的比對(duì)率無顯著差異。

AS患者的基因數(shù)和Shannon指數(shù)均顯著下降，PCoA圖也表明AS患者和HCs之間腸道微生物群的分布不同。

通過糞便宏基因組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)未經(jīng)治療的AS患者存在14個(gè)MGS增加，94個(gè)MGS減少。在被富集的MGS中，有7個(gè)被注釋，包括Bacteroidescoprophilus DSM_18228、Parabacteroides distasonis ATCC_8503、EubacteriumsiraeumV10Sc8a、Acidaminococcusfermentans VR4_DSM_20731-mgs0807和Prevotella copriCB7_DSM_18205（圖1）。

圖1 AS患者與健康對(duì)照組腸道微生物的MGS分析

有趣的是，23名治療后患者的糞便樣本表明Prevotella copriCB7_DSM_18205減少了（圖2A）。一些AS減少的物種如 Enterococcusfaecium E980和TX0133a01經(jīng)治療后增加了。此外，在接受TNFi/DMARDs治療的患者中，AS富集物種Prevotella copri CB7_DSM_18205比僅接受非甾體抗炎藥（NSAIDs）的患者恢復(fù)更為顯著(圖2B)。

圖2 部分恢復(fù)的AS患者腸道微生物群

至于功能分析，有三個(gè)主要途徑涉及AS，包括氧化磷酸化，脂多糖（LPS）生物合成和糖胺聚糖降解（圖3）。與氧化磷酸化相反，AS患者腸道微生物群糖酵解和糖異生途徑減少。健康對(duì)照組中最富集的通路是磷酸烯醇丙酮酸依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶（PTS）系統(tǒng)和ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)體。值得注意的是，AS患者體內(nèi)一種具有抗炎活性的微生物代謝產(chǎn)物丁酸的代謝途徑減少，且丙酸代謝亦呈下降趨勢（圖3）。

2.   腸道微生物群與臨床指標(biāo)和診斷模型的相關(guān)性分析

在所有測試的臨床指標(biāo)中，貝氏強(qiáng)直性脊椎炎活性指數(shù)（BASDAI）與AS患者腸道微生物群密切相關(guān)。此外，我們發(fā)現(xiàn)AS富集菌Acidaminococcusfermentans VR4_DSM_20731的相對(duì)豐度與BASDAI呈現(xiàn)正相關(guān)，而AS富集菌Parabacteroides distasonisATCC_8503則相反。AcidaminococcusfermentansVR4_DSM_20731也和一種外周關(guān)節(jié)炎表型相關(guān)。在AS腸道中減少的Ruminococcus obeum A2?162和 Dorea longicatena DSM_13814與HLA-B27的存在呈正相關(guān)。

此外，我們還建立了隨機(jī)森林模型，70%的樣本被隨機(jī)挑選為訓(xùn)練集，余下的30%則組成了測試集，訓(xùn)練集和測試集的受試者工作特征曲線下面積分別為 89.7%和82.6%（圖4A）。18種MGS標(biāo)志物被鑒定為主要的分類器，其中在AS腸道中下降的Gordonibacterpamelaeae7-10-1-bT_DSM_19378具有最高預(yù)測準(zhǔn)確性，Bacteroidescoprophilus DSM_18228在AS富集菌中最高預(yù)測準(zhǔn)確性。此外，我們發(fā)現(xiàn)與治療前相比，治療后疾病的概率下降（圖4C）。

3.   不同炎性關(guān)節(jié)炎的比較分析

為了研究不同炎癥性關(guān)節(jié)炎患者腸道微生物群的一致性和差異性，我們利用了我們隊(duì)列和其他已發(fā)表隊(duì)列的數(shù)據(jù)，分別獲得57例RA和24例BD的宏基因組序列數(shù)據(jù)，并得到物種和功能注釋。

我們發(fā)現(xiàn)Bacteroides fragilisNCTC_9343、Bilophilawadsorthia3_1_6和AlistipesfinegoldiiAHN_2437_DSM_17242在炎性關(guān)節(jié)炎腸道中上升，而Prevotellabivia653C_DSM_20514和EubacteriumbiformeDSM_3989則相反。我們?cè)俅谓⒘艘粋€(gè)隨機(jī)森林模型，以確定是否存在針對(duì)不同炎癥性關(guān)節(jié)炎的特定生物標(biāo)記物。根據(jù)微生物特征對(duì)不同炎性關(guān)節(jié)炎的聚類顯示，AS和RA之間的關(guān)系比其他組更密切，這與它們都是炎性關(guān)節(jié)炎的臨床性質(zhì)一致。根據(jù)最小最大轉(zhuǎn)化重要度指數(shù)，包括GordonibacterPamelaae7-10-1-bT_DSM 19378和Sutterellawadsworthensis 3_1_ 45B在內(nèi)的類群的變化與AS和RA高度相關(guān)。隨機(jī)森林模型中包括三種Faecalibacteriumprausnitzii（一種在AS患者中減少并通常報(bào)告有益的丁酸鹽產(chǎn)生菌），可以區(qū)分不同的組，并且每種菌都與三種炎癥性關(guān)節(jié)炎有明顯的關(guān)系（圖5）。

我們進(jìn)一步比較了三種不同炎癥性關(guān)節(jié)炎的途徑和模塊模式。在細(xì)菌分泌系統(tǒng)方面，Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）在自身免疫宏基因組的豐度明顯高于對(duì)照組。糖酵解被證明是RA和BD中最豐富的途徑，但AS患者更傾向氧化磷酸化和              檸檬酸循環(huán)。糖胺聚糖降解途徑與其他多糖降解在AS和RA的腸道菌群中，顯著增加。

4.   AS腸道富集菌產(chǎn)生微生物肽增強(qiáng)IFN-γ產(chǎn)生能力

為了從實(shí)驗(yàn)上證實(shí)AS與腸道微生物之間的潛在關(guān)系，我們將AS腸道中上調(diào)的物種（Q<0.1）的蛋白質(zhì)序列與從IEDB（免疫表位數(shù)據(jù)庫3.0）檢索到的自體表位進(jìn)行了匹配，后被證明通過抗原抗體反應(yīng)刺激AS患者的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。三種細(xì)菌肽與AS自體表位的相似度超過80%，均由HLA-B27提呈抗原肽給CD8⁺T細(xì)胞。鑒于IFN-γ的產(chǎn)生通常被用作CD8⁺T細(xì)胞活化的指標(biāo)，我們隨后進(jìn)行了ELISPOT實(shí)驗(yàn)來測試這些肽誘導(dǎo)的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）的IFN-γ分泌。被Bacteroides fragilis 3_1_12 的“HIGQPGVIG”模擬來自II型膠原的“ARGQPGVMG”刺激后，只有來自于具有HLA-B27的AS患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞而不是來自健康受試者的外周血單個(gè)核細(xì)胞表現(xiàn)出過度的IFN-γ產(chǎn)生能力（圖6）。

圖6 模擬自身抗原的微生物肽能夠觸發(fā)IFN-γ的分泌

在這里，我們的宏基因組研究確定了AS腸道微環(huán)境的一些組成和功能模式，并將我們的發(fā)現(xiàn)與來自其他炎癥性關(guān)節(jié)炎隊(duì)列的宏基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較。我們發(fā)現(xiàn)，Bacteroides coprophilus、Parabacteroides distasonis、Eubacterium siraeum、 Acidaminococcusfermentans和Prevotella copri是AS腸道中特異性富集的標(biāo)志物，并增加了氧化磷酸化、LPS生物合成和糖胺聚糖降解等途徑。我們也構(gòu)建了一個(gè)MGS為基礎(chǔ)的性能良好的隨機(jī)森林分類器。ELISPOT實(shí)驗(yàn)證明一種AS富含菌種所產(chǎn)生的肽，模擬AS自身抗原II型膠原，作為以IFN-γ分泌為特征的自身免疫反應(yīng)的觸發(fā)因子。AS患者α多樣性降低，其特征是基因數(shù)和Shannon指數(shù)均下調(diào)。基于Bray-Curtis距離的降維分析也揭示了AS患者和HC之間的微生物分布差異。在我們的AS隊(duì)列中，發(fā)現(xiàn)包括Bacteroides coprophilus、Parabacteroides distasonis、Eubacterium siraeum、Acidaminococcus fermentans和 Prevotellacopri在內(nèi)的物種增加，其中Prevotella copri先前被另一個(gè)宏基因組研究認(rèn)為在AS腸道中升高。然而，之前的研究并沒有排除服用免疫抑制藥物的患者，據(jù)報(bào)道這些藥物會(huì)干擾腸道微環(huán)境。我們對(duì)AS患者的隨訪數(shù)據(jù)和先前對(duì)RA患者的觀察都清楚地表明，DMARDs治療可以影響腸道微生物群的組成。例如，AS所富含菌Prevotella copri在治療后顯著減少。有趣的是，用DMARDs或TNF-α抑制劑（TNFi）治療比僅用非甾體抗炎藥治療有更大的降低Prevotella copri的能力。Prevotella copri是上述最突出的一種，與許多具有致病性的疾病有關(guān)，尤其是在炎癥性關(guān)節(jié)炎中。據(jù)報(bào)道，它在臨床前類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中富集，且在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的滑液中檢測到它的DNA。此外，在無菌條件下對(duì)關(guān)節(jié)炎具有抵抗力的關(guān)節(jié)炎小鼠模型，在單殖入Prevotella copri后發(fā)生了嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎，并伴有豐富的結(jié)腸和腘淋巴結(jié)中的Th17細(xì)胞。鑒于AS是脊椎關(guān)節(jié)炎的原型，關(guān)節(jié)炎的一個(gè)常見亞型，上述事實(shí)提示了 Prevotella copri和AS之間可能存在因果關(guān)系。 

根據(jù)宏基因組序列的功能注釋，AS患者的腸道微生物群具有增加的氧化磷酸化和檸檬酸鹽循環(huán)，以及減少的糖酵解。選擇耗氧量較大的能量代謝可能反映了紊亂腸道微生物所面臨的氧化應(yīng)激，有利于兼性厭氧菌的生存，而不是大多數(shù)專性厭氧的腸道共生菌。AS腸道菌群的內(nèi)毒素的生物合成和輸出功能均提升，與AS患者血清LPS水平升高一致。據(jù)報(bào)道，當(dāng)脂多糖被注射到小鼠關(guān)節(jié)時(shí)，也會(huì)引發(fā)關(guān)節(jié)炎，這表明升高的脂多糖對(duì)AS具有致病作用。糖胺聚糖是骨基質(zhì)的主要有機(jī)成分，硫酸化的糖胺聚糖可以保護(hù)膠原纖維免受酸變性。其他研究報(bào)道糖胺聚糖是腸屏障的重要組成部分。AS患者體內(nèi)糖胺聚糖降解途徑增加，提示其可能導(dǎo)致骨破壞和腸道完整性損害。PTS系統(tǒng)和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體都是微生物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的重要組成部分，其在腸道內(nèi)的下調(diào)表明微生物維持細(xì)胞內(nèi)分子平衡的能力有缺陷。丁酸代謝在腸道菌群中減少。丁酸鹽是SCFAs的主要成分之一，長期以來一直具有很強(qiáng)的抗炎作用。與這一觀察結(jié)果一致，我們的AS患者中也發(fā)現(xiàn)了一些能夠產(chǎn)生SCFAs的物種，如Eubacterium hallii、Coprococcus catus、Faecalibacterium prausnitzii和Coprococcus eutactus減少。為了使這些微生物組成數(shù)據(jù)具有臨床意義，我們對(duì)未經(jīng)治療的AS患者的腸道微生物相對(duì)豐度和臨床指標(biāo)進(jìn)行了Spearman相關(guān)分析。BASDAI是最常用的疾病活動(dòng)評(píng)分，與腸道微生物分布的相關(guān)性最強(qiáng)。Acidaminococcus fermentans是唯一與BASDAI呈顯著正相關(guān)的AS富集菌種。然而，Acidaminococcusfermentans與人類病理的聯(lián)系尚未得到研究。 Ruminococcus obeum和Coprococcus catus與AS疾病活力得分呈負(fù)相關(guān)，且在AS腸道中呈下降趨勢，提示這兩種共生菌的有益作用。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)在腸道中減少的Ruminococcus obeum和Dorea longicatena與HLA-B27的存在呈正相關(guān)?；?/span>MGS相對(duì)豐度建立隨機(jī)森林分類模型，將AS患者與HC患者區(qū)分開來，訓(xùn)練組和測試組的AUC分別達(dá)到89.7%和82.6%。最具鑒別力的MGS是一種在AS腸道中減少的物種即Gordonibacterpamelaeae。 Gordonibacter pamelaeae以其在鞣花酸代謝中的作用而聞名。尿石素A是鞣花代謝產(chǎn)物，據(jù)報(bào)道通過抑制中性粒細(xì)胞發(fā)揮抗炎活性。研究還表明鞣花酸能改善炎癥性結(jié)腸炎和關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥反應(yīng)。

在具有可比樣本量的AS、RA和BD隊(duì)列中進(jìn)行多隊(duì)列分析，以探討炎癥性疾病腸道微生物群的共同特征。結(jié)果表明，在這些炎癥性疾病中，Bacteroides fragilis (NCTC_9343)、Bilophilwadsworthia和Alistipes finegoldii上升，而 Prevotella bivia和Eubacterium biforme則相反。據(jù)報(bào)道，Bacteroides fragilis在兒童附著點(diǎn)相關(guān)關(guān)節(jié)炎中增多。然而，Bacteroides fragilis的多糖A與抗炎特性相關(guān)，而Bacteroides fragilis毒素?fù)?jù)報(bào)道是促炎和致癌的。因此，Bacteroides fragilis在免疫病理中的確切作用值得進(jìn)一步研究。眾所周知，Bilophila wadsworthia是一種亞硫酸鹽還原性致病菌，能夠產(chǎn)生有害的代謝物硫化氫，據(jù)報(bào)道，當(dāng)口服給特定的無致病性小鼠時(shí)，會(huì)引發(fā)全身炎癥。另一個(gè)豐富的物種Alistipes finegoldii激活I(lǐng)L-6/STAT3信號(hào)促進(jìn)結(jié)腸炎小鼠炎癥反應(yīng)。就通常改變的功能而言，T3SS分泌功能在所有三個(gè)關(guān)節(jié)炎隊(duì)列中明顯富集。T3SS像注射器一樣向宿主細(xì)胞輸送毒力因子，可能通過誘導(dǎo)組蛋白H3的去磷酸化和去乙酰化，擾亂許多細(xì)胞功能，如細(xì)胞骨架、運(yùn)輸和細(xì)胞死亡。在我們的AS隊(duì)列中，T3SS模塊的升高可能是由Tannerella sp、Eubacterium siraeum、Bacteroidesfragilis和Odoribacter splanchnicus等物種的富集引起的，它們都具有這種分泌系統(tǒng)。

在AS和RA隊(duì)列中，大量減少的Gordonibacter pamelaeae和富集的Sutterella wadsworthensis是最具鑒別能力的物種。Sutterella wadsworthensis在潰瘍性結(jié)腸炎接受分菌移植后未能達(dá)到緩解的患者中增加，提示其對(duì)平衡腸道菌群的干擾作用。Sutterella wadsworthensis能刺激腸細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素（IL）-8，白細(xì)胞介素是一種能誘導(dǎo)炎癥趨化和吞噬的化學(xué)因子。有趣的是，AS患者的血清IL-8水平與AS疾病活動(dòng)評(píng)分呈正相關(guān)，AS患者的回腸IL-8表達(dá)也與腸道炎癥有關(guān)。

自體抗原和微生物組分之間的交叉反應(yīng)一直被認(rèn)為是自身免疫的觸發(fā)因素。利用生物信息比對(duì)，我們從我們的AS隊(duì)列中富集的物種中發(fā)現(xiàn)了三種微生物肽，它們與已證實(shí)的AS自身表位有著密切的相似性。脆弱擬桿菌表達(dá)的一種微生物肽“HIGQPGVIG”能刺激AS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌IFN-γ，而健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞則無相同的炎癥反應(yīng)。這不是第一次脆弱擬桿菌與分子模擬有關(guān)。脆弱擬桿菌的BfUbb蛋白可能與人泛素相似，與自身免疫病人血清IgG結(jié)合。我們新發(fā)現(xiàn)的脆弱擬桿菌肽模擬的人類蛋白質(zhì)是II型膠原，是關(guān)節(jié)軟骨的主要結(jié)構(gòu)。因此，我們有理由推測，由微生物肽引發(fā)的自身抗體可能通過損傷炎性關(guān)節(jié)軟骨加重病情的發(fā)展。盡管已經(jīng)在AS患者中進(jìn)行了多項(xiàng)腸道微生物群研究，但我們?nèi)赃h(yuǎn)未明確腸道微生物群失調(diào)與AS發(fā)病之間的因果關(guān)系。與其他炎癥性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）不同，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)展已被證明部分歸因于腸道失調(diào)，任何特定微生物類群與AS發(fā)病機(jī)制之間的確切關(guān)系尚未報(bào)道。

通常，各種微生物都可以發(fā)揮作用，因?yàn)槲⑸锶捍碇粋€(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，沒有一種微生物能區(qū)分開來HC和AS。盡管我們的模擬研究揭示了受干擾的微生物可能對(duì)AS的影響，但利用純化的微生物和動(dòng)物模型進(jìn)行進(jìn)一步的機(jī)制研究是有必要的。此外，還應(yīng)探索和揭示介導(dǎo)特定分類群對(duì)AS病理學(xué)影響的確切微生物成分或代謝物。

綜上所述，我們對(duì)未經(jīng)治療的患者糞便樣本進(jìn)行深度測序的結(jié)果表明，腸道微生物群在AS腸道中受到干擾，這是由AS隊(duì)列和HCs之間的組成和功能差異所揭示的。利用相關(guān)的微生物特征建立診斷性隨機(jī)森林模型，取得了良好的效果，強(qiáng)調(diào)了特定分類群在鑒別AS患者和預(yù)測預(yù)后方面的潛力。此外，不同炎性關(guān)節(jié)炎組間的比較分析揭示了一些微生物和途徑的致病作用，揭示了一些共同的特征。最后，體外實(shí)驗(yàn)證明了一種微生物肽通過分子模擬促進(jìn)異常免疫反應(yīng)的能力，這可能是HLA-B27陽性AS的觸發(fā)因素?？傊?，我們的研究提供了與AS腸道失調(diào)相關(guān)的深入知識(shí)，而新發(fā)現(xiàn)的AS相關(guān)腸道微生物的確切作用和功能途徑值得進(jìn)一步探索。

你可能還喜歡

1. 2019年度回顧 | 微生態(tài)環(huán)境微生物類微文大合輯
   

2. 2019年度回顧 | 微生態(tài)人體/動(dòng)物微生物類微文大合輯

3. 2019年度回顧 | 技術(shù)貼合輯大放送