Next-generation RNA Sequencing–based Biomarker Characterization of Chromophobe Renal Cell Carcinoma and Related Oncocytic Neoplasms

RNA-seq測序分析腎細(xì)胞癌及其嗜酸細(xì)胞相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物

腎細(xì)胞癌(RCC)是最常見的成人腎惡性腫瘤。由于多項臨床、組織學(xué)和分子研究的發(fā)展，RCC分類從1997年海德堡分類的4個(1997海德堡分類)擴展到2016年世界衛(wèi)生組織分類的12個亞型。最近全面的基因組和轉(zhuǎn)錄組研究揭示了不同組織學(xué)RCC亞型的特征性畸變。腎細(xì)胞癌(ChRCC)約占腎惡性腫瘤的5%，典型的大細(xì)胞型，細(xì)胞邊界突出，胞漿淡至嗜酸性，核呈葡萄干狀。嗜酸性粒細(xì)胞性ChRCC具有腺泡結(jié)構(gòu)，豐富的嗜酸性細(xì)胞質(zhì)，局灶性核褶皺。盡管大多數(shù)病例可以根據(jù)形態(tài)進(jìn)行分類，但仍有病例顯示出與其他分類相似的形態(tài)，包括透明細(xì)胞RCC（CCRCC），MiT家族易位性RCC（t-RCC），雜合性嗜酸細(xì)胞腫瘤（hybrid oncocytic tumor），嗜酸細(xì)胞型乳頭狀腎細(xì)胞癌（PRCC）和腎嗜酸細(xì)胞瘤（oncocytoma）。來自癌癥基因組圖譜(TCGA)的泛RCC研究表明，大約5–6％ CCRCC，乳頭狀RCC（PRCC）中包含的腫瘤和ChRCC隊列最初被錯誤分類。作者基于TCGA腎細(xì)胞癌數(shù)據(jù)進(jìn)行腎細(xì)胞癌及相關(guān)嗜酸細(xì)胞腫瘤生物標(biāo)志物的鑒定。

使用TCGA、MCTP篩選ChRCC的RNAseq數(shù)據(jù)和來自其他RCC亞型和正常腎組織（圖1a），limma確定2751個上調(diào)和2107個下調(diào)基因?；趦蓛杀容^ChRCC與CCRCC，PRCC和稀有RCC類型之間的差異，1268個基因作為候選的ChRCC生物標(biāo)志物。然后根據(jù)其的表達(dá)水平和顯著性進(jìn)行排名， FOXI1、LINC01187、RHCG和HEPACAM2（HEPACAM家族成員2）基因排名最高。這些生物標(biāo)記在scRNA-seq數(shù)據(jù)上被注釋為基于譜系的特定基因（與插層細(xì)胞有關(guān)）。KLK15，LRRTM1和LINC00588被注釋為癌癥特異性基因由ChRCC表達(dá)的癌癥特異性基因。這些基因在最初的TCGA ChRCC病例中升高根據(jù)組織學(xué)評估診斷為其他亞型，提示其可作為生物標(biāo)志物。

圖1 ChRCC生物標(biāo)志物的確定

緊接著作者通過免疫組化方法在包含197個樣品隊列評估了FOXI1和RHCG蛋白并用RNA-ISH在162個樣本隊列同樣評估了LINC01187。

圖2.生物標(biāo)志物在正常腎臟中的表達(dá)

原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性ChRCC(圖3a-d)的FOXI1免疫組化染色呈彌漫性、強陽性核染色。相比之下，其他RCC亞型如原發(fā)性CCRCC或轉(zhuǎn)移部位未見染色。在肉瘤樣ChRCC中，F(xiàn)OXI1蛋白染色僅局限于上皮樣腫瘤細(xì)胞成分，包括上皮樣細(xì)胞被梭形細(xì)胞包裹在肉瘤樣成分中而高階梭形細(xì)胞成分以陰性為主。所有嗜酸性ChRCCs顯示FOXI1染色陽性。腎嗜酸細(xì)胞瘤和具有嗜酸細(xì)胞特征的未分類RCC也顯示FOXI1陽性染色。所有評估的hot(最常見的是在Birt-Hogg-Dube綜合征患者中遇到的)顯示了一種雙重表型，即只有一種腫瘤上皮細(xì)胞群fox1染色陽性，導(dǎo)致染色模式呈方格狀。

圖3.典型ChRCC

無原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性CCRCC、CCPRCC、原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性 PRCC、富馬酸水合酶(FH)缺陷RCC、收集管癌(CDC)或MTSCC顯示Fox1染色。8例原發(fā)性t-RCCs中有3例(37.5%)表現(xiàn)為非常弱，F(xiàn)OXI1核染色呈散在細(xì)胞，轉(zhuǎn)移性t-RCC呈陰性(表1)。

表1.驗證隊列中FOXI1表達(dá)匯總

之前觀察到RHCG免疫組化染色方式如下:環(huán)周膜樣染色、頂杯樣染色和高爾基樣/分泌樣染色。原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性大鱗癌中發(fā)現(xiàn)彌漫、強環(huán)周膜性RHCG染色，而原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性大鱗癌中發(fā)現(xiàn)RHCG染色陰性。

圖4.透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌

但肉瘤樣ChRCC顯示上皮樣腫瘤細(xì)胞成分中環(huán)繞膜狀RHCG染色，包括包裹在肉瘤樣成分中的上皮樣細(xì)胞。嗜酸性粒細(xì)胞性ChRCC表現(xiàn)為高爾基樣/分泌(6/10,60%;)或根尖杯狀(4/ 10,40%)RHCG染色。所有嗜酸細(xì)胞瘤和低級別嗜酸細(xì)胞未分類的RCCs均顯示尖杯狀RHCG染色;熱組的單腫瘤上皮細(xì)胞群也是如此，再次導(dǎo)致方格狀外觀。無原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性CCRCC、CCPRCC、原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性PRCC、Fh缺陷RCC、CDC或MTSCC顯示RHCG染色。1 / 2的t-RCC病例表現(xiàn)為斑片狀膜性RHCG染色。這一發(fā)現(xiàn)僅部分符合灶性/弱核FOXI1染色，轉(zhuǎn)移性tRCC呈陰性，詳細(xì)的數(shù)據(jù)如表2。

表2.驗證隊列中RHCG表達(dá)匯總

通過對167個RCC樣本的整個組織切片進(jìn)行LINC01187 RNA-ISH。在最終分析中納入的病例總數(shù)為162/167 (97%)，5例因陽性對照失敗而被排除。32例典型chrcc中可見高水平的LINC01 187核表達(dá)(平均H值= 371;范圍= 247-398)和5例轉(zhuǎn)移性腎癌的18/18個轉(zhuǎn)移部位(平均H評分= 368;范圍= 308 - 400;圖3g,3h)，原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性CCRCCs(圖4g,4h)無表達(dá)(H評分= 0)。

表3.LINC01187在驗證隊列中的表達(dá)概況

肉瘤樣ChRCC在典型的ChRCC上皮樣腫瘤細(xì)胞成分中表達(dá)LINC01187，而在高級別梭形細(xì)胞成分中表達(dá)LINC01 187。8個嗜酸性粒細(xì)胞中有6個具有高的LINC01187表達(dá)(平均H值= 254;陽性病例range = 250 ~ 386，陰性2例H評分= 4)。具有嗜酸細(xì)胞特征和嗜酸細(xì)胞瘤的未分類RCCs也表現(xiàn)出高的LINC01 187表達(dá)(平均H評分= 377;范圍= 189-400)，這提示腫瘤起源于共同腎元段。所有HOTs均表現(xiàn)出雙重(格子)表型，只有一組細(xì)胞表達(dá)高水平的LINC01187。所有4個ChRCC活檢樣本均顯示腫瘤內(nèi)高表達(dá)LINC01187。原發(fā)性CCRCC(圖4g)、CCPRCC、PRCC、tRCC、CDC、MTSCC均未檢測到LINC01187RNA表達(dá)(所有32例原發(fā)性病例H評分均為0)。所有轉(zhuǎn)移non-ChRCC病例,包括CCRCC(圖4 h)和PRCC，以及一個轉(zhuǎn)移性肉瘤樣的ChRCC顯示沒有LINC01187表達(dá)式(表3)。FOXI1 LINC01187雙RNA-ISH經(jīng)典染色法證明ChRCC coexpression FOXI1和LINC01187大多數(shù)經(jīng)典ChRCC腫瘤上皮細(xì)胞間細(xì)胞在鄰近正常腎臟,支持認(rèn)為ChRCC源于遠(yuǎn)端腎單位。

圖5.FOX1和LINC01 187的RNA原位雜交

最后作者從5名患者收集的18個不同轉(zhuǎn)移部位評估了Fox1、RHCG和LINC01187在轉(zhuǎn)移性ChRCC腫瘤中的染色，發(fā)現(xiàn)所有樣本呈彌漫強FOXI1染色，周圍膜狀RHCG染色，LINC01 187高表達(dá)(H評分>300)。圖6顯示大網(wǎng)膜、右腰肌、胃和腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ChRCC染色。這說明了Fox1、RHCG蛋白和LINC01187轉(zhuǎn)錄本在空間和時間上的一致表達(dá)。

圖6.生物標(biāo)志物在轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤中的表達(dá)

在評估FOXI1、RHCG和LINC01 187的表達(dá)時，發(fā)現(xiàn)10例嗜酸性粒細(xì)胞性ChRCC中有2例FOXI1核染色極低，而LINC01 187的表達(dá)大部分為陰性。腫瘤呈彌漫性高爾基樣/分泌性RHCG染色。為評估這兩例病例是否代表一種不同的疾病亞型(具有不同分子表現(xiàn)的嗜酸性ChRCC或類似嗜酸性ChRCC的形態(tài))，對匹配的腫瘤和良性腎臟樣本進(jìn)行了全外顯子組測序，以識別突變、拷貝數(shù)模式和RNAseq，以評估轉(zhuǎn)錄組畸變。有充分的文獻(xiàn)證明，慢性腎病患者有反復(fù)的單拷貝丟失染色體(1、2、6、10、13和17)。根據(jù)拷貝數(shù)變異分析，指標(biāo)病例是這些染色體的二倍體。兩個病例都包含MTOR基因激酶域的熱點錯義激活突變(p.S2215Y, p.L2427Q)。從TCGA數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了另外3例最初診斷為ChRCC或PRCC的病例，測序后重新分類為混合RCC與MTOR激酶結(jié)構(gòu)域突變，并且如預(yù)期的那樣缺乏fox1和LINC01 187基因表達(dá)。

本文中作者結(jié)合了TCGA、內(nèi)部RCC分析和正常人腎組織scRNA-seq研究，并對來自1049個RCC標(biāo)本的RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，在ChRCC中鑒定出了ChRCC中FOXI1，RHCG和LINC01187。通過IHC和RNA- ISH在197例RCC病例的整個組織切片中評估了FOXI1、RHCG和LINC01187 mRNA蛋白的表達(dá)模式，包括原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤，從而證明了FOXI1，RHCG和LINC01187是發(fā)色腎細(xì)胞癌的譜系特異性特征基因，這有助于幫助確認(rèn)起源細(xì)胞并可能有助于腎腫瘤的準(zhǔn)確分類和診斷。