1.    成果轉(zhuǎn)化

表觀遺傳的科研成果向臨床的轉(zhuǎn)化道路漫長且費用高昂。在產(chǎn)品開發(fā)的最初過程中，除了上述所需要準備且經(jīng)歷的臨床驗證和資質(zhì)申報等過程，擬議的IVD產(chǎn)品還必須提供比所帶來的商業(yè)價值，以吸引成果轉(zhuǎn)化所需的大量資金投入。除了產(chǎn)品與市場的契合度之外，知識產(chǎn)權(quán)的實用性，向投資人提供的臨床證據(jù)的穩(wěn)健性和質(zhì)量，以及擬議市場中監(jiān)管環(huán)境的性質(zhì)都是吸引投資的關(guān)鍵因素。同時，為了讓醫(yī)學人士愿意接受實際應用，產(chǎn)品的實用性和臨床依據(jù)必須要在經(jīng)過同行權(quán)威評審的科學和醫(yī)學雜志中發(fā)表，并在會議和研討會上展示。本章節(jié)內(nèi)容將針對知識產(chǎn)權(quán)（IP），以及如何為監(jiān)管機構(gòu)，投資人和醫(yī)療專業(yè)人員提供高質(zhì)量的臨床證據(jù)進行探討。

1.1 知識產(chǎn)權(quán)

自2000年以來，表觀遺傳學領(lǐng)域的專利數(shù)量急劇上升，這主要是受到新型診斷技術(shù)和表觀遺傳技術(shù)專利的推動。專利權(quán)為公司提供了20年的獨家使用biomarker的權(quán)利，并幫助生物技術(shù)和制藥公司收回用于開發(fā)臨床IVD產(chǎn)品的相關(guān)成本。例如通過授權(quán)使用，向?qū)嶒炇业葯C構(gòu)收取費用。專利保護雖然對商業(yè)轉(zhuǎn)化很重要，但也會阻止創(chuàng)新，因為它會阻止臨床研究機構(gòu)對流程的改進以提高biomarker的檢測效率，如縮短檢測時間，提高靈敏度或檢測準確性等。在某些情況下，專利保護也會導致臨床檢測服務(wù)的壟斷，從而導致定價過高并超出普通人群的承受范圍。例如由Myriad提供的BRCA檢測。長期以來，biomarker專利的社會和經(jīng)濟影響一直是哲學辯論的主題。2013年，法院針對美國分子病理學協(xié)會與Myriad Genetics公司之間專利訴訟的判決，和2012年針對Mayo Collaborative Services與Prometheus Labs訴訟的判決，讓基于基因的診斷產(chǎn)品的專利申請在美國變得更加困難（Dreyfuss等。 在上述裁決中規(guī)定，基于生物相關(guān)的診斷方法不是新穎的，而是“自然法則”。

為了響應法院的裁決，生物制藥行業(yè)尋求了新的策略來描述其知識產(chǎn)權(quán)的獨特性和創(chuàng)造性。 如果在新的檢測方法開發(fā)中更需要體現(xiàn)產(chǎn)品的新穎性和邏輯性，那么可以預期，美國的IVD診斷公司會將新穎的biomarker與新的（可專利的）檢測方法相結(jié)合。而美國以外的公司可能會尋求在不適用法院判決的歐洲和/或亞太市場建立知識產(chǎn)權(quán)。對于尋求資金的較小公司而言，專利合作條約（PCT）一旦在全國實施之后，在美國專利商標局對關(guān)鍵專利要求沒有進行明確解釋之前，對PCT要求的有效性的不確定性可能使得在美國籌集資金更加困難。只有在收到專利審查員的評論后，才能確定IP投資的價值，然而這可能是在首次提交專利之后的數(shù)年。隨著2019年5月美國宣布的兩黨，兩院制法案草案（美國參議院，2019年）旨在改革《專利法》第101條，一些立法者現(xiàn)在正在尋求減少早期法院裁決的影響，并支持biomarker具有專利性。

1.2 監(jiān)管

盡管有類似于含有10個成員轄區(qū)的國際醫(yī)療器械監(jiān)管者論壇（IMDRF; http://www.）之類的機構(gòu)正在努力實現(xiàn)有關(guān)IVD的全球監(jiān)管統(tǒng)一，但在可預見的未來中，不同地區(qū)的監(jiān)管仍將存在巨大的差異，這也將大大提高了檢測分析的臨床轉(zhuǎn)化難度。 在轉(zhuǎn)化過程中盡早考慮地理位置的優(yōu)先級尤為重要，因為需要為監(jiān)管機構(gòu)量身定制適當?shù)臄?shù)據(jù)資料。對監(jiān)管體系的深入分析已超出本報告的范圍，但下面的內(nèi)容將對美國和歐洲市場有關(guān)的注意事項進行簡要總結(jié)和介紹。

在美國，存在三種不同的監(jiān)管途徑來獲得FDA的IVD審批許可。510（k）監(jiān)管途徑適用于與現(xiàn)有的評斷檢測產(chǎn)品基本等效的新測試，而市場上沒有經(jīng)過評斷的產(chǎn)品則應從頭進行分類，以進行較低風險的檢測，如果存在高風險，則應進行上市前批準（PMA）。 例如癌癥診斷產(chǎn)品，如果產(chǎn)品是在指定實驗室中針對醫(yī)生采集的患者樣本在“內(nèi)部”進行的，則該檢測可能會根據(jù)“自定”準則進行銷售，該準則在美國被稱為實驗室開發(fā)檢測（LDT）。目前，醫(yī)療保險和醫(yī)療補助中心（CMS）通過《1988年臨床實驗室改進修正案》（CLIA）對運行LDT的臨床實驗室進行管理。 CMS同時還可以批準其他認證方法，例如從州許可方案或其他組織，例如美國病理學家學院（College of American Pathologists, CAP））獲得批準。 CLIA法規(guī)涉及實驗室的標準，以及通過兩年一次的調(diào)查以評估產(chǎn)品的分析有效性（準確度和精確度），并且實驗室可以在評估之前開始分發(fā)檢測結(jié)果。CMS的CLIA項目不涉及任何檢測的臨床有效性，即產(chǎn)品用以識別、檢測或預測患者是否存在臨床狀況或傾向的準確性。FDA表示，由于其復雜性不斷提高，打算對LDT加強監(jiān)管（FDA，2014年）。 FDA指南顯示出有意盡早引入LDT監(jiān)管，對分析有效性進行更可靠的驗證以及對臨床有效性的要求。FDA還引入了高，中和低風險LDT的概念，無意監(jiān)管低風險LDT，也無意滿足未滿足的需求或罕見疾病進行測試。而癌癥診斷檢測被歸類為高危LDT，因此，無論選擇PMA還是LDT途徑，目前正在開發(fā)的診斷方法都應準備充足的證明分析數(shù)據(jù)和臨床有效性。

在歐洲，于1998年制定了體外醫(yī)療器械指令（IVDD）98/79 / EC，以協(xié)調(diào)產(chǎn)品合格和評估程序的標準，并幫助建立統(tǒng)一的IVD泛歐市場。在歐洲上市的所有IVD都必須具有CE認證，代表該IVD設(shè)備符合IVDD。根據(jù)該法律，IVD制造商僅需自行聲明該產(chǎn)品符合相關(guān)歐洲法律的基本要求。隨著IVD市場的不斷發(fā)展，歐盟委員會認為有必要進行修訂。從2008年起開始進行公眾咨詢，新的《體外診斷醫(yī)療器械條例》（IVDR）（EU）2017/746出臺，該立法于2017年5月26日生效，過渡期為五年，到2022年5月26日全面實施（歐洲議會，2017年）。當前受監(jiān)管的IVD沒有“繼承“條款，因此所有現(xiàn)有的受監(jiān)管IVD都需要再次進行CE認證。

IVDR與國際標準化組織（ISO）準則更加一致，并引入了基于風險的分類系統(tǒng)，并由公告機構(gòu)加強監(jiān)督。 這些類別基于“全球協(xié)調(diào)工作組”分類方案（IMDRF的前身），并確定了四個風險類別A-D，其中類別D為最高風險。用于癌癥篩查，診斷和分期的IVD歸類為C級，需要完整的質(zhì)量管理體系。在單個衛(wèi)生機構(gòu)內(nèi)進行和使用的“內(nèi)部”測試不必符合IVDR，但它們要求實驗室符合EN ISO 15189（醫(yī)學實驗室，質(zhì)量和能力要求），并且衛(wèi)生機構(gòu)必須提供無商購的替代品證明，方能使用該產(chǎn)品進行檢測。IVDR還要求遵守通用數(shù)據(jù)保護法規(guī)（GDPR），以將樣品用于規(guī)定目的（歐盟，2018年）。為此，在臨床試驗的早期需要考慮是否遵守GDPR。與IVDD相比，IVDR對診斷產(chǎn)品的分析性能要求更高，其中包括對參考材料和方法的要求。

1.3 質(zhì)量管理體系

任何尋求認證的IVD都需要提供質(zhì)量管理體系（Quality Management System, QMS）證明，并遵守良好生產(chǎn)規(guī)范（Good Manufacturing Practice, GMP）要求。這為合格評定和持續(xù)的上市后責任（例如質(zhì)量控制，外部質(zhì)量保證和不良事件報告）提供了框架工作。 每個司法管轄區(qū)都有不同的合格評定程序。 考慮到全球協(xié)調(diào)性，IMDRF于2012年啟動了醫(yī)療器械單一審核計劃（MDSAP）。參與到MDSAP的監(jiān)管機構(gòu)為了協(xié)調(diào)接受度，并滿足QMS和GMP的要求，要求審計機構(gòu)可以對一家醫(yī)療器械制造商進行一次審計。

對于在美國提交的PMA，F(xiàn)DA需要確保產(chǎn)品存在合理的設(shè)計和生產(chǎn)監(jiān)控，并有權(quán)進行批準前檢查。在產(chǎn)品審批后8到12個月內(nèi)，F(xiàn)DA還需進行審批后檢查。然而LDT不必遵守FDA質(zhì)量體系法規(guī)，也不必接受FDA檢查。LDT（在其他國家/地區(qū)也稱為“內(nèi)部” IVD）是根據(jù)實驗室網(wǎng)絡(luò)的合規(guī)性進行監(jiān)管的。許多國家已經(jīng)將ISO 15189納入其強制性醫(yī)學實驗室認證要求的一部分，但是在美國，對ISO 15189標準的認證不符合CLIA要求，并且不能替代基于CLIA的認證。與監(jiān)管途徑類似，轉(zhuǎn)化管轄權(quán)的優(yōu)先級應為質(zhì)量管理體系的設(shè)計提供依據(jù)。現(xiàn)有標準也會隨著時間而變化，并且會引入新的標準。與癌癥診斷相關(guān)，有關(guān)“評估核酸靶序列定量方法性能的要求——qPCR和dPCR”的新ISO標準（ISO / FDIS 20395）正在制定中（國際標準化組織，2019年）。

在計劃診斷測試的轉(zhuǎn)化時，最為重要的是要為監(jiān)管機構(gòu)提供足夠支持分析和臨床有效性的合理技術(shù)設(shè)計及證據(jù)。 監(jiān)管者還必須確信，該證據(jù)是從IVD的預期目標人群中收集的。 作為構(gòu)建適當證據(jù)的指南，非營利組織臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）制定了一套與診斷行業(yè)相關(guān)的指南。他們的“臨床實驗室測量程序的檢測能力評估”指南文件旨在供IVD制造商，監(jiān)管機構(gòu)和臨床實驗室使用，為臨床實驗室測量程序的檢測限的評估和記錄提供指導（臨床和實驗室標準協(xié)會，2012）。

2.    展望

當前，在開發(fā)基于DNA甲基化的IVD產(chǎn)品中有眾多新的突破和進展。隨著GRAIL等公司不斷證明cfDNA的甲基組測序比體細胞突變測序更能用于癌癥的初步診斷，社會對這一領(lǐng)域的關(guān)注只會增加。新興趨勢是將更多的甲基化biomarker組合用于多癌檢測和組織溯源?，F(xiàn)有幾項研究表明，cfDNA的甲基化狀態(tài)可用于預測其來源組織，諸如EarlyDiagnostics等公司目前正在將這些技術(shù)進行轉(zhuǎn)化。使用癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)設(shè)計的9223個CpG位點的大型血漿cfDNA組合已被證明能夠高精度地檢測常見晚期癌癥和潛在癌癥類型。與基準醫(yī)療（中國廣州）合作的研究最近表明，一組9種亞硫酸氫鹽測序擴增子可以高靈敏度檢測血漿早期肺癌。

癌癥IVD領(lǐng)域的另一個新興趨勢是基于多分析物檢測，例如將體細胞突變檢測和免疫測定相結(jié)合的CancerSEEK。最近，Guardant Health收購了Bellwether Bio，這將使他們能夠在NGS ctDNA分析中納入核小體定位和片段組學信息。最近發(fā)現(xiàn)基于cfDNA片段長度的一項研究（一種間接測量核小體定位的方法）具有良好的臨床應用價值。

隨著NGS成本的不斷降低，使用全甲基基因組進行biomarker的發(fā)現(xiàn)變得越來越普遍。有了足夠的受試者和測序深度，所有高實用性的biomarker都將被識別出來。一些正在開發(fā)的測試，例如用于膀胱癌檢測的UroMark中150biomarker，就是基于全基因組測序的挖掘成果。

此外，在檢測DNA甲基化狀態(tài)方面有許多新的創(chuàng)新技術(shù)。兩種新的基于酶的DNA轉(zhuǎn)化方法，Enzymatic Methyl-seq和TET輔助的吡啶硼烷測序（TAPS）便是利用酶來轉(zhuǎn)化DNA。相比亞硫酸鹽的氧化處理，在溫和的沒處理條件下，可以提供更高的可擴增DNA的回收率，并且所得DNA無論是在靶向技術(shù)或是NGS技術(shù)中都可作為更優(yōu)質(zhì)的檢測源。隨著第三代測序技術(shù)的不斷發(fā)展，為直接表觀遺傳檢測提供了新的機會。為此，三個研究團隊已經(jīng)開始訓練和測試了機器學習方法，以在牛津納米孔技術(shù)MinION設(shè)備上檢測甲基化DNA，并展現(xiàn)出良好的結(jié)果。但是，低樣本量，片段短的cfDNA不是這些長片段閱讀平臺的最佳選擇。利用物理化學特性直接檢測甲基化DNA的新方法Methylscape也是一項令人振奮的創(chuàng)新，它為廉價的泛癌測試提供了潛在發(fā)展空間。

DNA甲基化IVD領(lǐng)域的持續(xù)技術(shù)發(fā)展和商業(yè)化行為不斷加速，創(chuàng)造了一種快節(jié)奏、創(chuàng)新和競爭性的環(huán)境，這樣的環(huán)境在未來中無論是在疾病早篩還是治療效果中，都將為患者帶來巨大收益。

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