摘要

目的：本研究是為了評(píng)估大腸癌相關(guān)的甲基化DNA標(biāo)志物(MDM)在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性大腸癌中的一致性，為利用血漿檢測(cè)遠(yuǎn)端復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的大腸癌提供可行性。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：選擇了一組已報(bào)道的與大腸癌相關(guān)的MDM標(biāo)志物。用甲基化特異性定量PCR檢測(cè)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性大腸癌組織中的MDM。用靶標(biāo)富集長(zhǎng)探針定量放大信號(hào)法測(cè)定血漿中的MDMs。用隨機(jī)森林模型對(duì)原發(fā)性大腸癌患者血漿樣本中MDM的進(jìn)行預(yù)測(cè)。該模型算法在預(yù)先采集的復(fù)發(fā)大腸癌患者的血漿樣本中得到了驗(yàn)證。隨機(jī)森林模型是較為靈敏和特異的，其準(zhǔn)確性可以用曲線下面積(AUC)來(lái)進(jìn)行評(píng)估。

結(jié)果：在選定的14個(gè)MDM中，有12個(gè)MDM(86%)在原發(fā)組織和轉(zhuǎn)移組織之間的具有中度或高度的一致性。預(yù)設(shè)特異性為95%(91%-98%)的情況下，在97例大腸癌患者和200例健康對(duì)照者的血漿中有13個(gè)MDM對(duì)Ⅳ期大腸癌的敏感性為100%(80%-100%)，AUC為0.91(0.87-0.95)，顯著高于癌胚抗原,AUC為0.72(0.65-0.79)。這組MDM在40例患者和60例健康對(duì)照者的血漿中，復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的敏感性為90%(76%-97%)，特異性為90%(79%-96%)，AUC為0.96(0.92-1.00)。它們?cè)?0例大腸癌術(shù)后無(wú)疾病的患者中，呈陽(yáng)性的概率為0.30(0.19-0.43)。

結(jié)論:針對(duì)新型大腸癌關(guān)于血漿MDM的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可以可靠地檢測(cè)出原發(fā)性大腸癌和復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的大腸癌，并且具有良好的準(zhǔn)確性。

介紹

盡管目前癌癥的篩查和治療工作都取得了進(jìn)展，但結(jié)直腸癌仍然是最常見(jiàn)和最致命的癌癥之一，這部分歸因于結(jié)直腸癌的篩查率。此外，接受根治性切除手術(shù)的患者近一半會(huì)有復(fù)發(fā)的情況。幾項(xiàng)大型研究表明，通過(guò)血液和影像學(xué)檢查這種綜合監(jiān)測(cè)手段可以檢測(cè)癥狀前的復(fù)發(fā)，并改善轉(zhuǎn)移性疾病的預(yù)后，在這些轉(zhuǎn)移性疾病中，治療可指向治愈。

目前的監(jiān)控工具精度不高，成本昂貴。其中影像學(xué)檢查可能會(huì)遺漏病灶或彌漫性病變，無(wú)法反映總體腫瘤情況。而生物標(biāo)記物，血漿癌胚抗原(CEA)，敏感性和特異性較低。因此，顯然需要一種比癌胚抗原具有更好的性能特征、成本更低、靈敏度更高的非侵入性監(jiān)測(cè)工具。

循環(huán)DNA (cfDNA)突變標(biāo)記的液體活檢在改善結(jié)直腸癌切除患者的預(yù)后中顯示出很高價(jià)值。然而，這種方法對(duì)于篩查或監(jiān)測(cè)早期的結(jié)直腸癌是不實(shí)用的，因?yàn)楸仨氁写罅客蛔兾稽c(diǎn)以供分析。對(duì)每個(gè)個(gè)體原發(fā)性腫瘤確定的突變定制靶向標(biāo)記物的策略包括高成本的測(cè)序和特定的監(jiān)測(cè)分析，但是由于轉(zhuǎn)移的遺傳進(jìn)化等因素，不能保證這些靶點(diǎn)在患者治療過(guò)程中保持穩(wěn)定。

甲基化的DNA標(biāo)記物(MDM)在篩查和監(jiān)測(cè)結(jié)直腸癌方面與現(xiàn)有工具相比具有幾個(gè)優(yōu)勢(shì)(圖1A)。有研究表明，在檢測(cè)原發(fā)性結(jié)直腸癌方面，檢測(cè)MDM優(yōu)于CEA。MDM是原型表觀遺傳標(biāo)記，在結(jié)腸直腸癌篩查中也比獲得性突變標(biāo)記攜帶有更廣泛的信息，具有一定的敏感性。它與結(jié)直腸癌體細(xì)胞遺傳突變的獲得性分子差異相似，一些MDM與腫瘤行為和對(duì)輔助化療的反應(yīng)相關(guān)，反映了腫瘤的異質(zhì)性。我們團(tuán)隊(duì)曾利用新一代測(cè)序方法發(fā)現(xiàn)了一種與原發(fā)性結(jié)直腸癌組織密切相關(guān)的新型MDM，我們現(xiàn)假設(shè)這種MDM可以應(yīng)用于液體活檢來(lái)檢測(cè)早期原發(fā)性結(jié)直腸癌和無(wú)創(chuàng)檢測(cè)復(fù)發(fā)性結(jié)直腸癌。

本研究有三個(gè)平行且獨(dú)立的目標(biāo)。首先，我們?cè)噲D評(píng)估結(jié)直腸癌原發(fā)和轉(zhuǎn)移之間MDM候選標(biāo)志物的一致性(原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性組織MDM一致性研究)，高一致性的MDM將應(yīng)用在復(fù)發(fā)疾病的檢測(cè)中。其次，我們通過(guò)檢測(cè)早期結(jié)直腸癌患者和健康對(duì)照(早期結(jié)直腸癌初步檢測(cè)研究)血漿中MDM，為監(jiān)測(cè)研究設(shè)定標(biāo)志物的臨界點(diǎn)水平，以此來(lái)評(píng)價(jià)MDM在結(jié)直腸癌早期診斷中的敏感性和特異性。最后，開(kāi)發(fā)的檢測(cè)早期原發(fā)性結(jié)直腸癌的檢測(cè)模型會(huì)被應(yīng)用于第三類病例的進(jìn)行對(duì)照研究，以確定接受過(guò)治療的結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性的可能性，并與那些沒(méi)有放射學(xué)證據(jù)的結(jié)直腸癌患者(NED)和健康對(duì)照(MDM血漿結(jié)直腸癌監(jiān)測(cè)研究)進(jìn)行比較。

圖1：MDM在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中的使用與基于突變的生物標(biāo)記物進(jìn)行比較的研究原理(A)和三項(xiàng)主要的平行研究概述(B)。(1)原發(fā)和轉(zhuǎn)移組織MDM一致性研究，評(píng)估原發(fā)和轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌MDM隨時(shí)間變化的一致性；(2)MDM血漿結(jié)直腸癌早期初步檢測(cè)研究，評(píng)價(jià)MDM對(duì)原發(fā)性結(jié)直腸癌早期發(fā)現(xiàn)的敏感性和特異性；(3)MDM血漿結(jié)直腸癌監(jiān)測(cè)研究，評(píng)價(jià)MDM檢測(cè)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌的敏感性和特異性。

材料和方法

所有研究程序都是在Mayo研究所(Rochester, MN)機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)根據(jù)美國(guó)共同規(guī)則(衛(wèi)生與公眾服務(wù)部第45CFR第46條)批準(zhǔn)后進(jìn)行的。

MDM在原發(fā)和轉(zhuǎn)移組織的一致性研究

手術(shù)切除的原發(fā)和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，包括同步或異時(shí)轉(zhuǎn)移，是從Mayo診所組織登記處(Rochester, MN)得到的，可以根據(jù)SNOMED病理診斷代碼的查詢。同步轉(zhuǎn)移是指發(fā)生在3個(gè)月內(nèi)的遠(yuǎn)程轉(zhuǎn)移，異時(shí)性轉(zhuǎn)移是指相對(duì)于最初診斷的結(jié)直腸癌超過(guò)3個(gè)月的轉(zhuǎn)移。與供者簽署書面同意，且供試者年齡至少18歲；排除標(biāo)準(zhǔn)為所研究腫瘤部位的放射史和已知的家族性癌癥綜合征(如林奇綜合征和家族性腺瘤性息肉病)。在取回福爾馬林固定的石蠟包埋的組織標(biāo)本后，胃腸病理學(xué)家(T.T.Wu)證實(shí)了診斷，根據(jù)病理切片確定了腫瘤的位置，并估計(jì)了腫瘤的純度。相關(guān)的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床和組織病理學(xué)信息被標(biāo)注在存檔了的腫瘤樣本來(lái)源的患者身上。臨床表型由研究人員根據(jù)預(yù)先指定的方案進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并由臨床醫(yī)生專家(謝海峰)審查其準(zhǔn)確性。

根據(jù)MDM水平[四分位數(shù)區(qū)間(IQR)，155-12,476]的較高中位數(shù)，選擇了一組由14個(gè)MDM(VAV3，CHST2，OPLAH，QKI，PPP2R5C，ARHGEF4，PDGFD，ZNF625，SFMBT2，LRRC4，DOCK10，IKZF1，NDRG4和BMP3)構(gòu)成的MDM組，它們是之前被確定為對(duì)原發(fā)性結(jié)直腸癌具有高度特異性的MDM。如前所述，使用定量甲基化特異性PCR(MSP)來(lái)測(cè)量每個(gè)選定的MDM。簡(jiǎn)而言之，用EZ DNA甲基化試劑盒(Zymo Research)對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理，并在緩沖液中洗脫。將亞硫酸氫鹽處理過(guò)的DNA作為模板，用基于熒光的實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行甲基化定量。每個(gè)標(biāo)記的引物被設(shè)計(jì)成針對(duì)每個(gè)基因的亞硫酸氫鹽修飾的甲基化序列(集成DNA技術(shù))。β-肌動(dòng)蛋白基因中沒(méi)有CpG位點(diǎn)的區(qū)域被用作亞硫酸氫鹽處理的參考。組織DNA樣品用SYBR Green Master Mix(Roche)進(jìn)行PCR。所有反應(yīng)均在Roche 480型LightCycler上進(jìn)行。以雙硫代甲基化的CpGenome通用甲基化DNA(微孔)作為陽(yáng)性對(duì)照，并連續(xù)稀釋以生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

血漿中MDM檢測(cè)早期原發(fā)性結(jié)直腸癌的初步研究

在未治療癌癥檔案(ClinicalTrials.gov NCT03662204)的患者中，分別采集了健康對(duì)照(ClinicalTrials.gov NCT03628638)和結(jié)直腸癌患者的6mL血漿，這些患者在2018年9月1日至2019年3月31日期間提供了書面知情同意?；颊呔聪惹盎蛲瑫r(shí)診斷出其他癌癥，主要是指在過(guò)去5年內(nèi)任何的癌癥診斷(基底細(xì)胞或鱗狀細(xì)胞皮膚癌除外)；在任何時(shí)間范圍內(nèi)同一原發(fā)癌復(fù)發(fā)；或同時(shí)診斷出多原發(fā)癌。值得注意的是，如果靶病理細(xì)針抽吸(FNA)與采血間隔小于3d，靶病理活檢(FNA除外)與采血間隔小于7d，或在采血后24h內(nèi)接受靜脈造影劑(如CT、MRI)檢查，則不能使用該標(biāo)本。

整個(gè)外周靜脈血液樣本采集在LBGuard Tubes(Biomatrica)中，它使用專有的核酸保存介質(zhì)來(lái)維持細(xì)胞完整性和目標(biāo)DNA分析物回收，并可以在采集后8天內(nèi)在室溫下對(duì)樣本進(jìn)行集中處理。

取儲(chǔ)存在﹣80℃下的血漿樣品。從樣品中提取DNA(QIAamp Circulating Nucleic Acid試劑盒，Qiagen)，再進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。由于血漿中cfDNA豐度較低，選用的MDM主要采用由Exact Sciences開(kāi)發(fā)的靶向富集長(zhǎng)探針定量放大信號(hào)(TELQAS)方法進(jìn)行檢測(cè)和定量，該檢測(cè)方法的詳細(xì)步驟已在以前公布。簡(jiǎn)而言之，對(duì)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA進(jìn)行有限循環(huán)(12個(gè)循環(huán))多重PCR擴(kuò)增MDM。PCR產(chǎn)物用10 mmol/L Tris-HCl和0.1 mmol/L EDTA溶液稀釋10倍，取10μL稀釋后用于三重LQAS分析，定量?jī)煞NMDM。MDM被歸一化為B3GALT6的甲基化序列，B3GALT6是亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的總DNA輸入的量度。TELQAS反應(yīng)在ABI 7500DX設(shè)備(應(yīng)用生物系統(tǒng))上進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)中MDM的TELQAS檢測(cè)是獨(dú)立于組織研究結(jié)果而設(shè)計(jì)的，而VAV3、CHST2、QKI、PDGFD和SFMBT2在組織研究中是常見(jiàn)的。因?yàn)檫@些研究是非順序進(jìn)行的，所以在臨床前實(shí)驗(yàn)中顯示與結(jié)直腸癌有很強(qiáng)相關(guān)性的其他MDM被測(cè)試。由于TELQAS多路復(fù)用能力的限制和血漿中cfDNA含量的限制，不能同時(shí)研究所有感興趣的MDM。因此，血漿研究檢測(cè)了額外的新候選基因：JAM3、ZNF671、ZNF568、GRIN2D、DTX1、ANKRD13B、CNNM1和FER1L4。CEA檢測(cè)是根據(jù)制造商的說(shuō)明使用Cobas E411免疫分析分析儀(羅氏診斷公司)對(duì)10微升的血清樣本進(jìn)行的。

MDM血漿結(jié)直腸癌監(jiān)測(cè)研究

病例人群包括那些接受積極治療的新診斷或復(fù)發(fā)的結(jié)直腸癌患者，還包括那些II-IV期結(jié)直腸癌患者，這些患者在接受治療后目前患有NED?；颊邆兌冀邮芰薈EA和放射學(xué)的常規(guī)臨床檢查。在這項(xiàng)平行研究中，健康的非癌癥患者的血漿樣本作為陰性對(duì)照。

血漿CEA和血漿MDM大腸癌早期檢測(cè)研究中使用的MDM是從年齡和性別都較為平均的患者中測(cè)定的，包括健康對(duì)照組、NED患者和初次腫瘤切除后復(fù)發(fā)的大腸癌患者。來(lái)自早期結(jié)直腸癌初步檢測(cè)前期研究(上文)的交叉驗(yàn)證MDM預(yù)測(cè)模型被用于區(qū)分復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性癌癥(病例)和健康對(duì)照。然后將預(yù)測(cè)精度估計(jì)應(yīng)用于NED疾病對(duì)照組，以估計(jì)可能有微小殘留病的患者的百分比。

收到血樣后，立即旋轉(zhuǎn)分離血漿和棕黃色涂層組分，保存在﹣80℃下，經(jīng)DNA提取和亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后，對(duì)選定的MDM進(jìn)行TELQAS初步檢測(cè)和定量。本研究使用血漿樣本(4mL)檢測(cè)MDM。使用10微升的血漿進(jìn)行CEA分析，將血漿CEA結(jié)果與同一時(shí)間點(diǎn)收集的結(jié)直腸癌患者的臨床血清值進(jìn)行比較。

統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)于原發(fā)和轉(zhuǎn)移組織MDM一致性研究，用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(ICC)來(lái)評(píng)估原發(fā)和轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織中MDM水平之間的一致性水平，包括總體上的組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(ICC)和按同步和異時(shí)表現(xiàn)分層的組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(ICC)。簡(jiǎn)而言之，ICC總結(jié)了由于原發(fā)和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌組織之間的差異(不一致性)而觀察到的單個(gè)MDM水平總變異的百分比。根據(jù)Koo和Li的指導(dǎo)，ICC被認(rèn)為是指示差，ICC<50%；中等，50%≤ICC<75%；良好，75%≤ICC<90%；以及優(yōu)秀，ICC≥，相對(duì)于95%可信區(qū)間(CI；REF)的下限，符合率為90%。所需的樣本量是在將ICC的95%CI的寬度限制為不大于±10%的基礎(chǔ)上進(jìn)行總體比較的基礎(chǔ)上確定的。為了達(dá)到這個(gè)置信水平，假設(shè)ICC為30%，至少需要77名原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶配對(duì)的患者。除了用95%的CI匯總ICC外，原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌組織之間的相對(duì)差異在對(duì)數(shù)尺度上被總結(jié)為相應(yīng)的第25和75%的中位數(shù)和百分位數(shù)。

在大腸癌早期診斷先導(dǎo)研究中，共有14個(gè)MDM，包括B3GALT6和血清CEA檢測(cè)。每個(gè)MDM TELQAS產(chǎn)品都被標(biāo)準(zhǔn)化為甲基化的B3GALT6，最近被證明是比β-肌動(dòng)蛋白血漿分析更可靠的歸一化序列，應(yīng)用于測(cè)試數(shù)據(jù)集(即，結(jié)直腸癌監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù))內(nèi)的病例和對(duì)照。數(shù)據(jù)用于使用所有14個(gè)MDM(具有和不具有連續(xù)的CEA值)針對(duì)結(jié)直腸癌的隨機(jī)森林(RForest)預(yù)測(cè)算法(交叉驗(yàn)證)。簡(jiǎn)而言之，rForest模型由500個(gè)數(shù)據(jù)的引導(dǎo)隨機(jī)樣本組成。每個(gè)引導(dǎo)樣本用于創(chuàng)建單個(gè)遞歸分區(qū)/決策樹(shù)，從而產(chǎn)生500棵樹(shù)(每個(gè)引導(dǎo)樣本一個(gè))。來(lái)自獨(dú)立樣本(例如，在500棵樹(shù)中約1/3的個(gè)體未被用于訓(xùn)練)的獨(dú)立樣本的數(shù)據(jù)根據(jù)標(biāo)記水平被分類為結(jié)直腸癌(Y/N)，并記錄獨(dú)立樣本的結(jié)直腸癌陽(yáng)性樹(shù)的百分比。在訓(xùn)練了模型之后，確定了將某人歸類為結(jié)直腸癌所需的陽(yáng)性樹(shù)百分比的分界值(Y/N)，并將其設(shè)置為在95%的特異度分界值下執(zhí)行預(yù)測(cè)。然后將該模型直接應(yīng)用于結(jié)直腸癌監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)(測(cè)試集)，如果陽(yáng)性樹(shù)的百分比超過(guò)訓(xùn)練集的預(yù)定義截止值，則單個(gè)樣本被認(rèn)為是陽(yáng)性的。假設(shè)對(duì)照與病例的比例為2：1，總共有14個(gè)生物標(biāo)志物，訓(xùn)練的模型的平均絕對(duì)預(yù)測(cè)誤差為±10%，則至少需要175名患者的總樣本量。另一個(gè)考慮因素是要有足夠的樣本量，以便使用Bootstrap重采樣進(jìn)行模型靈敏度的交叉驗(yàn)證。為了使估計(jì)敏感度90%的95%可信區(qū)間不大于±10%，總共需要150名患者(50例患者和100名對(duì)照)用于測(cè)試集。結(jié)合這些要求，總共300名患者的總體研究樣本量是足以進(jìn)行訓(xùn)練和交叉驗(yàn)證的，訓(xùn)練：測(cè)試使用引導(dǎo)抽樣方案實(shí)現(xiàn)的數(shù)據(jù)分割的比率約為2：1。

在MDM血漿結(jié)直腸癌監(jiān)測(cè)研究中，樣本量是基于將使用MDM水平(有或沒(méi)有CEA)訓(xùn)練的預(yù)測(cè)的受試者工作特征(ROC)曲線(AUC)下的面積與單獨(dú)使用CEA進(jìn)行比較。根據(jù)估計(jì)的63%的敏感性和88%的特異性，CEA的預(yù)期AUC為0.75。要檢測(cè)80%功率的MDM水平的AUC為0.85或更高，假設(shè)顯著性為5%的單邊檢驗(yàn)，則至少需要64個(gè)病例和64個(gè)對(duì)照。在64例病例和64例對(duì)照中，假設(shè)每個(gè)病例的靈敏度和特異度均大于0.85，其95%可信區(qū)間的半寬度不大于±10%。在使用血漿中MDMS的早期原發(fā)性結(jié)直腸癌檢測(cè)試點(diǎn)研究中建立的有CEA和不有CEA的模型被應(yīng)用于預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者的癌癥診斷，并與健康對(duì)照組進(jìn)行比較。然后對(duì)患有NED的患者評(píng)估該模型的陽(yáng)性率。ROC分析用于評(píng)估訓(xùn)練模型的診斷準(zhǔn)確性，并總結(jié)為AUC和相應(yīng)的95%CI。通過(guò)比較分層AUC，評(píng)估RECIST標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量的腫瘤負(fù)荷與訓(xùn)練模型診斷準(zhǔn)確性的相關(guān)性。

連續(xù)變量用IQR總結(jié)為中位數(shù)，分類數(shù)據(jù)總結(jié)為組總數(shù)的百分比。非參數(shù)檢驗(yàn)用于患者亞組之間的比較(例如，順序數(shù)據(jù)的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)和分類數(shù)據(jù)的Fisher精確檢驗(yàn))。

結(jié)果

圖1B顯示了三個(gè)主要實(shí)驗(yàn)的概述，用來(lái)檢驗(yàn)我們的中心假設(shè)，即新的候選MDM在配對(duì)的原發(fā)和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌組織之間是一致的，并且一組這樣的MDM不僅可以成功地檢測(cè)原發(fā)結(jié)直腸癌，還可以成功地檢測(cè)血漿樣本中的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌。

原發(fā)和轉(zhuǎn)移組織MDM一致性研究

如補(bǔ)充表S1所示，MDM組織研究包括84例原發(fā)結(jié)直腸癌和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，其中56例為同步轉(zhuǎn)移，28例為異時(shí)轉(zhuǎn)移。原發(fā)性結(jié)直腸癌切除患者的年齡中位數(shù)為60.2歲。41例(49%)患者接受新輔助治療，56例(67%)患者接受輔助化療。56例(67%)患者患有左側(cè)結(jié)直腸癌。所有同步轉(zhuǎn)移均發(fā)生在肝臟。異時(shí)性轉(zhuǎn)移17例(61%)為肝轉(zhuǎn)移，10例(36%)為肺轉(zhuǎn)移。在14個(gè)選定的MDM中，1個(gè)MDM(7%)的CI大于≥75%表示一致性良好，9個(gè)(64%)的ICC≥為50%表示中度一致性，3個(gè)(21%)在綜合考慮所有轉(zhuǎn)移時(shí)一致性較差(補(bǔ)充表S2)。在配對(duì)的原發(fā)結(jié)直腸癌和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中，選定的14個(gè)MDM非常相似(圖2A)。當(dāng)選擇原發(fā)和同步轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(圖2B)、原發(fā)和異時(shí)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(圖2C)、左側(cè)原發(fā)和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(圖2D)以及右側(cè)原發(fā)和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(圖2E)時(shí)，這14個(gè)入選的MDM中的大多數(shù)水平是相似的。

在使用血漿中MDM的早期原發(fā)性結(jié)直腸癌檢測(cè)先導(dǎo)研究和MDM血漿結(jié)直腸癌監(jiān)測(cè)研究中，所有樣本在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和靶擴(kuò)增后都含有至少20000條B3GALT6。所有被檢測(cè)的樣品都包括在分析中。

圖2.原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌組織MDM水平的差異。當(dāng)將原發(fā)腫瘤水平除以轉(zhuǎn)移腫瘤水平時(shí)，差異表現(xiàn)為中位數(shù)和IQR倍數(shù)變化。總體(A)；原發(fā)結(jié)直腸癌與同步轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌之間(B)；原發(fā)結(jié)直腸癌與異時(shí)轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌之間(C)；左側(cè)原發(fā)結(jié)直腸癌與轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌之間(D)；右側(cè)原發(fā)結(jié)直腸癌與轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌之間(E)。折疊值>1表示原發(fā)灶MDM水平較高；值<1表示轉(zhuǎn)移灶MDM水平較高。

血漿中MDMS檢測(cè)早期原發(fā)性結(jié)直腸癌的初步研究

然后，我們將選定的MDM應(yīng)用于I-IV期原發(fā)性結(jié)直腸癌患者的血漿樣本存檔。包括97名結(jié)直腸癌患者和200名年齡和性別平衡的健康對(duì)照。大腸癌患者和健康對(duì)照組的年齡、性別和種族分布相似(表1)?？刂平M明顯更有可能是現(xiàn)在或以前的吸煙者。大腸癌中，Ⅳ期23例(23.7%)，Ⅲ期23例(24.7%)，Ⅱ期26例(26.8%)，Ⅰ期11例(11.3%)。在95%(91%-98%)的特異度下，有CEA的13個(gè)MDM對(duì)所有大腸癌分期的交叉驗(yàn)證靈敏度為78%(69%-86%)；沒(méi)有CEA的交叉驗(yàn)證靈敏度為77%(68%-85%)。模型的性能也被評(píng)估用于檢測(cè)結(jié)直腸癌的各個(gè)階段。在95%(91%-98%)的特異度下，有或沒(méi)有CEA的13個(gè)MDM對(duì)I期大腸癌的交叉驗(yàn)證敏感性為64%(31%-89%)，對(duì)II期大腸癌的敏感性分別為62%(41%-80%)和65%(44%-83%)，對(duì)III期大腸癌的敏感性分別為79%(58%-93%)和71%(49%-87%)，對(duì)IV期大腸癌的敏感性為100%(85%-100%)。單個(gè)MDM和CEA的表現(xiàn)也被總結(jié)為AUC值，如圖3所示。由13個(gè)MDM組成的小組能夠檢測(cè)到結(jié)直腸癌的所有階段，交叉驗(yàn)證的AUC為0.91(0.87-0.95)。添加癌胚抗原對(duì)AUC值沒(méi)有顯著改善[0.91(0.87-0.95)；P？0.5415]。個(gè)體MDM和CEA對(duì)rForest模型在早期結(jié)直腸癌與健康對(duì)照的分類中的貢獻(xiàn)的重要性如附圖所示。S2A。在13個(gè)MDM中，甲基化的JAM3和ZNF761對(duì)整體交叉驗(yàn)證模型算法的性能貢獻(xiàn)最大。模型的準(zhǔn)確性不受原發(fā)腫瘤位置(直腸、左半結(jié)腸和右半結(jié)腸)的影響。

表1 使用血漿中MDM的早期原發(fā)性結(jié)直腸癌檢測(cè)試點(diǎn)研究中患者的基本特征。

圖3.在使用血漿中的MDM進(jìn)行的早期原發(fā)性結(jié)直腸癌檢測(cè)試點(diǎn)研究中，單個(gè)MDM、CEA和一組血漿中的MDM在區(qū)分早期結(jié)直腸癌和健康對(duì)照方面的表現(xiàn)。AUC，ROC曲線下面積。

MDM血漿結(jié)直腸癌監(jiān)測(cè)研究

我們還應(yīng)用選定的MDM前瞻性地采集了160例年齡/性別平衡的患者的血漿樣本，其中包括60例健康對(duì)照、60例結(jié)直腸癌切除并NED患者和40例初次腫瘤切除術(shù)后復(fù)發(fā)的結(jié)直腸癌患者(包括10例輔助治療后復(fù)發(fā)的結(jié)直腸癌患者和30例積極保守治療的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者)?；颊叩钠骄挲g為55歲(IQR，49-64歲)，CEA水平中位數(shù)為1.7 ng/mL(IQR，1.1-3.2 ng/mL；表2)。考慮到早期原發(fā)性結(jié)直腸癌檢測(cè)的交叉驗(yàn)證模型的高度敏感性和特異性，使用血漿中的MDM檢測(cè)IV期結(jié)直腸癌的初步研究，我們?cè)u(píng)估了該模型在檢測(cè)復(fù)發(fā)結(jié)直腸癌中的作用。作為一項(xiàng)質(zhì)量控制檢查，在使用血漿中MDM的早期原發(fā)性結(jié)直腸癌檢測(cè)先導(dǎo)研究和結(jié)直腸癌監(jiān)測(cè)研究中，評(píng)估了MDM分布的潛在漂移。(JAM3，ZNF671，SFMBT2，CHST2對(duì)最終模型的性能貢獻(xiàn)最大，研究之間沒(méi)有明顯的漂移)。然而，對(duì)于使用血漿中MDMS的早期原發(fā)性結(jié)直腸癌檢測(cè)試點(diǎn)研究，CEA是從血清中檢測(cè)的，而對(duì)于結(jié)直腸癌監(jiān)測(cè)研究，CEA是從血漿中檢測(cè)的。與其他被檢測(cè)的標(biāo)記相比，CEA的分布發(fā)生了明顯的變化(補(bǔ)充圖S4)。這不能用患者之間的介質(zhì)(血清和血漿)的不同來(lái)解釋，在這些患者中，可以獲得臨床可用的血清CEA值(補(bǔ)充圖S5)。為了便于比較和使用根據(jù)早期原發(fā)結(jié)直腸癌檢測(cè)先導(dǎo)研究數(shù)據(jù)建立的模型中相同的CEA截止值，通過(guò)在每個(gè)研究的對(duì)照之間觀察到的平均CEA的比率，然后將該比例因子應(yīng)用于結(jié)直腸癌監(jiān)測(cè)研究中的病例和對(duì)照，得出了1.5的比例因子。在有或無(wú)CEA的MDM訓(xùn)練模型中，以95%的特異度為界值時(shí)，檢測(cè)復(fù)發(fā)結(jié)直腸癌的靈敏度為90%(76%~97%)，觀察到的特異度為90%(79%~96%)。加CEA的MDM模型的AUC值為0.96(0.92~1.0 0)，與不加CEA的MDM模型相似(P＝0.45)，但明顯優(yōu)于單獨(dú)使用CEA的MDM模型，AUC值為0.79(0.69~0.90；P＝0.0015)。

有或沒(méi)有CEA的MDM訓(xùn)練模型預(yù)測(cè)NED患者復(fù)發(fā)結(jié)直腸癌的概率分別為0.32(0.20-0.45)和0.30(0.19-0.43)(圖4)。有或沒(méi)有CEA的MDM訓(xùn)練模型在前一次隨訪時(shí)發(fā)現(xiàn)NED患者的復(fù)發(fā)結(jié)直腸癌的靈敏度為80%(44%-97%)，檢測(cè)到接受積極姑息治療的患者的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的靈敏度為93%(78%-99%)。有或沒(méi)有CEA的MDM小組檢測(cè)復(fù)發(fā)的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的敏感度為100%(86%-100%)，肺轉(zhuǎn)移的敏感度為89%(52%-100%)，腹膜/淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感度為57%(18%-90%)。RECIST sum>4 cm病變的敏感度為100%(81%~100%)，sum≤4cm病變的敏感度為83%(59%~96%)。有或沒(méi)有CEA的MDM小組檢測(cè)復(fù)發(fā)直腸癌的敏感度為92%(62%-100%)，左側(cè)結(jié)腸癌的敏感度為95%(75%-100%)，右側(cè)結(jié)腸癌的敏感度為75%(35%-97%)。與早期檢測(cè)研究一樣，NED或復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移性疾病患者的模型準(zhǔn)確性不受原發(fā)腫瘤位置(直腸與左半結(jié)腸與右半結(jié)腸)的影響。

表2.MDM血漿CRC監(jiān)測(cè)研究中患者的基本特征。

圖4，使用血漿中MDM進(jìn)行的早期原發(fā)性結(jié)直腸癌檢測(cè)先導(dǎo)研究和MDM血漿結(jié)直腸癌監(jiān)測(cè)研究的交叉驗(yàn)證模型的性能。A，每個(gè)患者組的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)集中出現(xiàn)結(jié)直腸癌的概率分布。B，復(fù)發(fā)結(jié)直腸癌MDM模型加CEA和不加CEA的ROC曲線與具有相應(yīng)AUC和95%順式的正常對(duì)照組相比。AUC，ROC曲線下面積。

討論

在這項(xiàng)研究中，使用了新一代測(cè)序方法發(fā)現(xiàn)過(guò)的一種與原發(fā)性結(jié)直腸癌組織密切相關(guān)的新型MDM，我們?cè)u(píng)估了與轉(zhuǎn)移組織來(lái)源的DNA相比，獨(dú)立原發(fā)腫瘤組織中MDM的一致性。其次，對(duì)候選MDM采用具有高分析靈敏度的TELQAS分析方法來(lái)分析原發(fā)性結(jié)直腸癌的早期檢測(cè)。這項(xiàng)技術(shù)隨后被應(yīng)用于獨(dú)立的病例、疾病對(duì)照和健康對(duì)照，以驗(yàn)證在治療時(shí)或治療后檢測(cè)患者復(fù)發(fā)結(jié)直腸癌的可行性。

最重要的是，研究結(jié)果表明，腫瘤特異性表觀遺傳學(xué)改變?cè)谠l(fā)性和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中是高度一致的，包括同步和異時(shí)轉(zhuǎn)移，盡管在使用新輔助治療或化療后有可能進(jìn)行克隆選擇。隨著時(shí)間的推移和接受治療后，似乎有最小的表觀遺傳漂移現(xiàn)在。在MDM組織研究中，我們發(fā)現(xiàn)所選的14種MDM在左側(cè)原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中的水平都是一致的。此外，與DNA突變的大型甲基化測(cè)量相比，對(duì)相對(duì)較小的交叉驗(yàn)證甲基化標(biāo)記物的靶向分析似乎顯示出在檢測(cè)早期疾病或復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移疾病的潛在臨床實(shí)用價(jià)值。雖然與健康對(duì)照組相比顯示出高度的特異性，但專家小組預(yù)測(cè)，手術(shù)后無(wú)ED的患者中有近三分之一可能患有結(jié)直腸癌，這表明可能存在“微小殘留病”。

MDM早期檢測(cè)試點(diǎn)研究旨在探索晚期疾病的準(zhǔn)確性，并據(jù)此選擇可應(yīng)用于監(jiān)測(cè)研究的MDM臨界值。應(yīng)該進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)的是，血漿中MDM的初步研究并不代表篩查和早期檢測(cè)的完全優(yōu)化的檢測(cè)方法，進(jìn)一步的研究正在進(jìn)行中。然而，很明顯，這種目前形式的血漿MDM檢測(cè)方法對(duì)IV期疾病的檢測(cè)具有很高的準(zhǔn)確性。以前的研究用相對(duì)較大的樣本量前瞻性地評(píng)估了cfDNA中幾種甲基化標(biāo)志物的準(zhǔn)確性，結(jié)果顯示對(duì)I-IV期結(jié)直腸癌的敏感度在48%到90%之間。通過(guò)TELQAS分析，我們證明了多種新的MDM在疾病的所有階段都有很好的準(zhǔn)確性；我們還觀察到隨著期數(shù)的增加，敏感性不斷增加，證實(shí)了腫瘤惡化與血漿cfDNA含量之間預(yù)期的正相關(guān)。然而，這些液體活檢早期檢測(cè)結(jié)直腸癌的觀察結(jié)果應(yīng)該謹(jǐn)慎看待。因?yàn)檫@項(xiàng)研究的病例對(duì)照設(shè)計(jì)不允許估計(jì)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，可能會(huì)對(duì)敏感性估計(jì)產(chǎn)生偏差，特別是對(duì)早期疾病，而且I期病例的數(shù)量相對(duì)較少。

我們?cè)趶?fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌方面的發(fā)現(xiàn)得到了其他文獻(xiàn)的支持。甲基化的BCAT1/IKZF1和WIF1/NPY已被證明是結(jié)直腸癌手術(shù)切除后或輔助化療期間優(yōu)于CEA的預(yù)后標(biāo)志物。在397例接受治療后監(jiān)測(cè)的結(jié)直腸癌患者中，甲基化的BCAT1/IKZF1預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)的敏感性僅為68%(95%CI，48%~84%)。在這項(xiàng)研究中，原發(fā)結(jié)直腸癌和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中MDM水平的高度一致性和在檢測(cè)原發(fā)結(jié)直腸癌方面的高準(zhǔn)確性之后，我們?cè)谝唤M監(jiān)測(cè)環(huán)境中沒(méi)有原發(fā)結(jié)直腸癌的腸外復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的鎖定模型中驗(yàn)證了血漿MDM測(cè)定的有效性。正如預(yù)期的那樣，在高特異性界值下，無(wú)論有沒(méi)有CEA，MDM都能夠以更高的靈敏度檢測(cè)復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌，特別是在有肝或肺轉(zhuǎn)移的患者，那些基于RECIST測(cè)量的腫瘤負(fù)荷大于4 cm的患者，以及那些左側(cè)原發(fā)性結(jié)直腸癌的患者。這一模型的表現(xiàn)似乎很有效，盡管之前對(duì)原發(fā)性結(jié)直腸癌進(jìn)行了治療，或者存在正在進(jìn)行的保守性化療。

另一方面，這項(xiàng)研究的樣本量有限，因?yàn)樗窃谇罢靶匝芯康谋尘跋率占难獫{樣本的橫斷面分析。我們的模型能夠預(yù)測(cè)與健康對(duì)照組相比，非ED患者發(fā)生結(jié)直腸癌的可能性增加。但NED復(fù)發(fā)的患者數(shù)量仍然很低。為了進(jìn)一步評(píng)估這些新型MDM在預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)和檢測(cè)“微小殘留病”方面的能力，與目前的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)相比，需要更長(zhǎng)的隨訪時(shí)間和足夠數(shù)量的實(shí)驗(yàn)樣板來(lái)排除NED患者的亞臨床復(fù)發(fā)的干擾。

綜上所述，MDM水平在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中高度一致。血漿檢測(cè)從原發(fā)性結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)的新的結(jié)直腸癌相關(guān)MDM似乎能夠可靠地檢測(cè)早期結(jié)直腸癌，對(duì)晚期疾病具有極高的敏感性。同一模型中的這些血漿MDM也可以檢測(cè)到遠(yuǎn)端復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌，準(zhǔn)確度令人滿意。MDM在結(jié)直腸癌非侵入性治療后監(jiān)測(cè)和治療監(jiān)測(cè)中的臨床應(yīng)用值得在有充分隨訪的縱向研究中進(jìn)一步評(píng)估。

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